Get 20M+ Full-Text Papers For Less Than $1.50/day. Start a 14-Day Trial for You or Your Team.

Learn More →

The Impact of Immunoglobulin G1 Fc Sialylation on Backbone Amide H/D Exchange

The Impact of Immunoglobulin G1 Fc Sialylation on Backbone Amide H/D Exchange Article  The Impact of Immunoglobulin G1 Fc Sialylation on  Backbone Amide H/D Exchange  1,2 1 1 1 3 Felix Kuhne  , Lea Bonnington  , Sebastian Malik  , Marco Thomann  , Cecile Avenal  ,  3 1,3 1 2 1, Florian Cymer  , Harald Wegele  , Dietmar Reusch  , Michael Mormann   and Patrick Bulau  *    Pharma Technical Development, Roche Diagnostics GmbH, Nonnenwald 2, 82377 Penzberg, Germany;  felix.kuhne@roche.com (F.K.); lea.bonnington@roche.com (L.B.); sebastian.malik@roche.com (S.M.);  marco.thomann@roche.com (M.T.); harald.wegele@roche.com (H.W.); dietmar.reusch@roche.com (D.R.)    Institute of Hygiene, University of Muenster, Robert‐Koch‐Strasse 41, 48149 Muenster, Germany;  mmormann@uni‐muenster.de    Pharma Technical Development Analytics Biologics, F. Hoffmann‐La Roche Ltd., 4070 Basel, Switzerland;  cecile.avenal@roche.com (C.A.); florian.cymer@roche.com (F.C.)  *  Correspondence: patrick.bulau@roche.com; Tel.: +49‐8856‐60‐18039  Received: 30 August 2019; Accepted: 26 September 2019; Published: 1 October 2019  Abstract: The usefulness of higher‐order structural information provided by hydrogen/deuterium  exchange‐mass spectrometry (H/DX‐MS) for the structural impact analyses of chemical and post‐ translational  antibody  modifications  has  been  demonstrated  in  various  studies.  However,  the  structure–function assessment for protein drugs in biopharmaceutical research and development is  often  impeded  by  the  relatively  low‐abundance  (below  5%)  of  critical  quality  attributes  or  by  overlapping effects of modifications, such as glycosylation, with chemical amino acid modifications;  e.g., oxidation or deamidation. We present results demonstrating the applicability of the H/DX‐MS  technique to monitor conformational changes of specific Fc glycosylation variants produced by in  vitro  glyco‐engineering  technology.  A  trend  towards  less  H/DX  in  Fc  Cγ2  domain  segments  correlating with larger glycan structures could be confirmed. Furthermore, significant deuterium  uptake differences and corresponding binding properties to Fc receptors (as monitored by SPR)  between α‐2,3‐ and α‐2,6‐sialylated Fc glycosylation variants were verified at sensitive levels.  Keywords:  hydrogen/deuterium  exchange;  mass  spectrometry;  Fc  glycosylation;  antibody  conformation; higher‐order structure; biopharmaceutical; antibody effector function; FcγR binding;  structure‐function; sialic acid linkage  1. Introduction  Glyco‐engineering  of  the  antibody  fragment  crystallizable  (Fc)  has  improved  the  immune  effector function of direct‐targeting therapeutic antibodies (Ab) for almost a decade. The first glyco‐ engineered monoclonal antibody (mAb) was approved by the US Food and Drug Administration  (FDA)  in  2012.  Mogamulizumab  (Poteligeo ,  Kyowa  Hakko  Kirin  Co.,  Ltd.,  Tokyo,  Japan)  is  a  humanized anti‐CC motif chemokine receptor 4 (CCR4) immunoglobulin G1 (IgG1) derived from  Chinese  hamster  ovary  (CHO)  cells  [1].  It  was  followed  by  Roche’s  anti‐CD20  obinutuzumab  (Gazyva )  in  2013.  Both  drugs  are  predominantly  afucosylated;  i.e.,  the  level  of  N‐glycan  core  fucosylation (Fuc) is significantly reduced. An enhanced antibody‐dependent cellular cytotoxicity  (ADCC)  of  up  to  100‐fold  compared  to  its  fucosylated  counterpart,  was  the  rationale  for  this  Fc  engineering milestone [2]. This improved Fc effector function was proposed to be induced by closer  carbohydrate contacts between the antibody Fc and the FcγRIII immune receptor glycans [3].  The Fc carbohydrate moiety is covalently linked to N297 (EU numbering [4]) in the C’E‐loop of  the antibody heavy chain Cγ2 domain. Its core is built of a chitobiose; i.e., two N‐acetylglucosamines  Antibodies 2019, 8, 49; doi:10.3390/antib8040049  www.mdpi.com/journal/antibodies  Antibodies 2019, 8, 49  2  of  19  (GlcNAc), and three branched α‐mannosyl residues (Man), either α‐1,3 or α‐1,6‐linked to the core  Man. Predominantly, Fc N‐glycans are bi‐antennary and core‐fucosylated at the GlcNAc1 (Figure 1).  The antennae consist of various monosaccharides, such as Man, GlcNAc, galactose (Gal), and/or sialic  acid;  e.g.,  N‐acetylneuraminic  acid  (NANA).  The  main  Fc  glycan  variants  to  be  found  in  bio‐ therapeutic antibodies are G0F, G1F, and G2F; however, many minor variants, such as G0, G1, G2,  M5, hM3F, G2S1F, and G2S2F are also generated during the bioprocess. The diversity of N‐glycan  structures greatly contributes to the product heterogeneity. Thus, glycan levels are monitored during  manufacturing as a process consistency parameter. Furthermore, as described for mogamulizumab,  the Fc glycosylation can affect the product’s immune effector function, thus needs to be evaluated as  a critical quality attribute (CQA).  Figure 1. Study design. Trastuzumab drug substance (DS) was in vitro glyco‐engineered (IVGE) with  individual enzymatic post‐process treatment, as described in the methods section. The trastuzumab  Fc glyco‐variants obtained (as determined by 2‐AB HILIC; see Table 1 for details): G0F (81%), G2F  (83%), G2S2F ST3 (60%), and G2S2F ST6 (43%). An additional trastuzumab Man5 variant (88%) was  prepared  by  kifunensine  treatment  during  the  fermentation  processing.  All  glyco‐variants  were  protein A purified after IVGE treatment and further structurally and functionally characterized with  2‐AB  HILIC,  SEC,  LC‐MS/MS  (quality  attributes),  HDX‐MS  (higher‐order  structure),  and  SPR  (functional testing).  Interestingly, upon receptor binding of Abs, the Fc carbohydrate moiety does not interact with  the FcγR protein structure directly [5–7]. As a consequence, the concept of fine‐tuning the immune  system’s  effector  function  by  regulating  the  Fc‐glycosylation  has  been  discussed  [8–10];  i.e.,  Fc  binding  is  naturally  modulated  through  interactions  of  the  specific  Fc  N‐glycan  structures  with  themselves and with  the  antibody protein structure.  Many of those interactions  are suspected to  stabilize the conformation of the receptor‐interacting Cγ2 domain. The Cγ2 C’E‐loop’s flexibility has  been  described  to  increase  with  shorter  carbohydrate  structures  [11–13],  which  in  turn  leads  to  decreased Fc binding activities [9,11,14]. Moreover, the stepwise enzymatic, as well as in silico glycan  truncation, revealed a twisting motion of the two Cγ2 domains relative to each other and a decrease  in distance between them with shorter glycans [11,12,15–17]. Taken together, the Fc‐glycosylation is  proposed to modulate and pre‐organize the receptor binding interface for optimal effector function  [13].  Antibodies 2019, 8, 49  3  of  19  Upon complete removal of the Fc N‐glycan, binding to the clinically relevant immune receptors  (i.e., FcγRI, FcγRIIa/b, and FcγRIIIa/b present on various leucocytes) is considerably reduced or even  completely eliminated [18,19]. Accordingly, de‐glycosylation has been shown to have a major impact  on the structural integrity of the Cγ2 domain [17]. With attached sugars, non‐covalent interactions  with the protein surface, mainly hydrophobic residues, increase [11]. Such site‐specific interactions  with  the  antibody  framework  have  been  described  for  the α‐1,6‐arm  GlcNAc  and  Gal  residues  [11,20,21]. GlcNAc has been observed to interact with F243, K246, and T260 [11,21]. Accordingly,  mutations of F241 and F243 led to reduced FcγRIII binding of hyper‐galactosylated IgG‐Fc molecules  [9,10]. For di‐galactosylated IgGs as well, the backbone amides of L243, F244, and K247 (according to  EU numbering [4]: L242, F243, and K246) have been interpreted as less solvent accessible due to the  interactions’ involvement [17,21]. In close agreement, doubly galactosylated Cγ2 domains have been  found  to  be  arranged  at  a  maximal  distance  to  each  other,  which  may  be  a  favored  interface  conformation  for  FcγRIII  interaction  [11].  In  any  case,  although  less  effective  than  afucosylation,  hyper‐galactosylation increases the mAb effector function [22,23]. Indeed, patients with rheumatoid  arthritis have been reported to exhibit more IgGs with G1F and G2F compared to healthy patients  [24].  Sialylation of the N‐glycan termini has been demonstrated to regulate the immune modulatory  feature (towards anti‐inflammatory properties) of so‐called intravenous immunoglobulins (IVIGs), a  mixed fraction of healthy donor IgGs for the treatment of immunoglobulin deficiency and various  immune‐mediated diseases; e.g., chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP) [25– 28]. Approximately 10%–11% of human IVIGs are sialylated and 1%–4% are di‐sialylated [26,27,29].  The  switch  from  pro  to  anti‐inflammatory  behavior  has  been  ascribed  again  to  conformational  changes in the Cγ2 domains and has been supported by functional and structural data [30,31]. Several  studies  observed  reduced  binding  affinities  of  sialylated  IgGs  for  FcγRs  and  their  consequent  reduction in cytotoxicity [26,31,32], whereas other reports did not demonstrate functional changes  upon  terminal  sialylation  [23,33,34].  Independent  from  Fc  function,  an  increase  in  inter‐domain  flexibility, including the reorientation of residue F241, and a slightly extended motion of the glycan  have  been  described  [6,30].  In  a  more  recent  in  silico  study,  Harbison  et  al.  demonstrated α‐2,6‐ linkages to show a higher conformational freedom, which allows for the increased motion of terminal  sialic acids α‐2,6‐linked to galactoses [35].  Many  biophysical  methods  fail  to  detect  such  minor  conformational  changes  of  large  bio‐ molecules, as they provide a global view on protein structure. The traditional analytical methods for  monitoring  higher‐order  structures  (HOS),  such  as  circular  dichroism  (CD),  Fourier‐transform  infrared spectroscopy (FTIR), UV, and fluorescence spectroscopy, are insufficiently sensitive to detect  minor  spatial  changes  in  large  proteins  such  as  antibodies,  and  rather,  deliver  information  only  pertaining to the entire averaged molecule. Changes induced in the HOS through chemical or post‐ translational  modifications  (PTM)  may  be  limited  to  specific  local  regions  in  the  protein,  which,  despite not affecting the overall structure, may still influence the bioactivity or pharmacokinetic (PK)  behavior of a bio‐therapeutic drug. Methods with an adequate structural resolution capability, e.g.,  X‐ray  crystallography,  fail  to  provide  dynamic  information  and are  quite  time‐consuming.  NMR  facilitates the investigation of molecular dynamics, but is restricted in terms of molecule size and  sample  concentration  [15].  The  potential  of  hydrogen/deuterium  exchange‐mass  spectrometry  (H/DX‐MS) as an alternative method to these traditional approaches has been demonstrated widely  in the literature [36]. Hydrogen/deuterium exchange (H/DX) monitors protein backbone dynamics,  as  amide‐bound  hydrogens  exchange  according  to  hydrogen  bond  formation  and/or  solvent  accessibility. HDX‐MS, therefore, screens static and dynamic molecular alterations that influence the  protein backbone.  Meanwhile, the application of H/DX‐MS in the biopharmaceutical industry has become well‐ established. Many examples of H/DX‐MS applied to structural changes in biopharmaceutical proteins  [37,38], including mAbs [17,39–42] exposed to extreme stress conditions, have been published. The  impact of chemical modifications and PTMs on the backbone amide hydrogen exchange behavior  have been studied intensively [17,21,40,43]; e.g., for methionine oxidation [17,40,43], de‐glycosylation  Antibodies 2019, 8, 49  4  of  19  [44,45],  de‐/hyper‐galactosylation  [17],  high  mannose  variants  [21,46],  and  afucosylation  [17].  Likewise, the applications of H/DX‐MS to characterizing mAb disulfide isoforms [47] and aggregates  [48] have also been reported. The utilization of H/DX‐MS for epitope mapping and ligand binding  investigations of therapeutic proteins is especially well‐established [49,50]. Recently, an improved  H/DX‐MS workflow for the detection of down to 1% Fc oxidation (M252) was published [43]. With  the developed approach described, we now demonstrate the applicability of the H/DX‐MS technique  to monitor relevant structural changes using enzymatically altered Fc glycosylations, created by the  previously introduced, in vitro glyco‐engineering (IVGE) technology [23]. As a model system for the  specific  CQA  assessment  of  bio‐therapeutic  proteins,  the  conformational  impact  of  defined  Fc  glycosylations on antibody effector function was systematically examined in this study. Trastuzumab  (Herceptin )  was  chosen  as  an  appropriate  model  for  the  investigation,  due  to  the  existence  of  extensive analytical and characterization data, in‐house and in the literature.  2. Materials and Methods  2.1. Enzymatic Preparation of Fc Glycan Variants  Trastuzumab  was  expressed  from  Chinese  hamster  ovary  (CHO)  cells  and  formulated  at 25  mg/mL  in  60  mM  histidine‐HCl  buffer,  pH  6.0.  Bioprocessing  was  conducted  for  Herceptin   manufacturing. Post‐process enzymatic treatment of trastuzumab (starting material) was performed  as  follows.  The  hypo‐galactosylated  “G0F”  variant  was  generated  by  addition  of  1.5  mL β‐1,4‐ galactosidase  (200  mU,  ProZyme  Inc.,  Hayward,  CA,  USA)  to  190  mg  starting  material  and  subsequent incubation at 37 °C for 24 h. For the hyper‐galactosylated “G2F” variant, 1.4 g starting  material was mixed with 220 mL reaction buffer (10 mM UDP‐Gal, 5 mM MnCl2, 100 mM MES, pH  6.5) and 42 mg β‐1,4‐galactosyltransferase (5.5 ± 0.5 mg/mL, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,  Germany), and incubated at 32 °C for 28 h. Further, 205 mg CMP‐NANA (c = 4 mg/mL in H2O) and  41 mg α‐2,3‐sialyltransferase or α‐2,6‐sialyltransferase (5.5 ± 0.5 mg/mL, Roche Diagnostics GmbH)  were added to 410 mg of the G2F variant to obtain the “ST3” or the “ST6” variant, respectively. The  samples  were  then  diluted  with  200  nM  alkaline  phosphatase  (AP)  and  0.1  mM  ZnCl2  (final  concentrations), and subsequently incubated at 37 °C for 24 h. For the ST6 variant, another 41 mg α‐ 2,6‐sialyltransferase and 200 mg CMP‐NANA (c = 10 mg/mL in H2O), as well as AP and ZnCl2 (final  concentrations: 264 nM and 0.1 mM) were added. The ST6 sample was then again incubated at 37 °C  for 17 h. To obtain the trastuzumab “Man5” high mannose variant, 0.1 μg/mL kifunensine was added  during cell cultivation (titer: 0.58 mg/mL trastuzumab). Purified material (mainly M5–M9 variants)  was buffer‐exchanged with 0.1 M sodium acetate, 0.5 mM CaCl2 (pH 5.0) and enzymatically glyco‐ engineered by the addition of 26 μg α‐1,2‐mannosidase (Genentech Inc., South San Francisco, CA,  USA) per mg mAb (to obtain predominantly M5 variants). The reaction was performed at 37 °C for  24 h. The de‐glycosylated variant (hereinafter denoted as “Degly”) was obtained by treatment of 380  mg starting material with 1.9 mL PNGaseF (250 U, Roche Diagnostics GmbH), further formulated  with 10 mM sodium phosphate, pH 7.2, and incubated at 37 °C for 24 h. The starting material was  also utilized as reference material “RM” throughout all experiments. Therefore, trastuzumab was  incubated in drug substance (DS) sample buffer at 37 °C for 24 h and otherwise treated analogously.  All  samples  were  finally  purified  by  Protein  A  chromatography  and  buffer‐exchanged  with  DS  sample buffer.  2.2. Analysis of Trastuzumab Quality Attributes  For  the  quantification  of  individual  glycan  species,  200 μg  trastuzumab  sample  was  buffer‐ exchanged  with  10  mM  ammonium  formate  buffer  (pH  8.6)  and  incubated  with  2 μL  PNGaseF  (500,000 units/mL, New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Germany) at 45 °C for 1 h. Glycan 2‐ aminobenzamide (2‐AB) labeling was performed at 65 °C for 2 h (Signal™ 2‐AB labeling kit, ProZyme  Inc.). Labeled glycans were hydrophilic interaction chromatography (HILIC)‐separated (Waters, BEH  Glycan 1.7 μm, 2.1 × 150 mm) and fluorescence‐detected on a Waters ACQUITY UPLC system, as  recently described [51].  Antibodies 2019, 8, 49  5  of  19  Liquid  chromatography‐mass  spectrometry  (LC‐MS/MS)  peptide  mapping  and  the  quantification  of  relevant  amino  acid  modifications  were  principally  conducted  as  previously  described [52,53]. In brief, all samples were denatured with 8 M Gua‐HCl (pH 6.0) and reduced with  10 μL (c = 0.1 g/mL) dithiothreitol (DTT) at 50 °C for 1 h. Samples were buffer‐exchanged (0.02 M His‐ HCl, pH 6.0) and further digested with 10 μL (c = 0.25 mg/mL) trypsin (Roche Diagnostics GmbH) at  37  °C  for  18  h.  Peptide  separation  (BEH  C18  1.7 μm,  2.1  ×  150  mm)  was  performed  on  a  Waters  ACQUITY UPLC system. Online mass spectrometric detection was generated with a Waters Synapt  G2 HDMS Q‐ToF mass spectrometer. For relative quantification of modified peptides, GRAMS AI  (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) was used.  Size exclusion chromatography (SEC) was performed with 20 μg protein sample on a Waters  Alliance HPLC instrument with a BioSuite™ column (250 Å, 5 μm, 7.8 × 300 mm). With mobile phases  of 200 mM KH2PO4 and 250 mM KCl (pH 7.0), and at a flow rate of 0.5 mL/min, variants were UV280  detected and peak‐integrated for the quantification of molecular weight species.  2.3. FcγR Binding Study  An in‐house study on the Fc binding characteristics, as evaluated by surface plasmon resonance  (SPR) analysis, has been recently published in the journal Bioanalysis (Future Science Ltd., London,  UK) [54]. It covers the data sets discussed in this manuscript, but with a focus on functionality. The  data was re‐assessed for direct comparison to the starting material for the experiments herein. The  interactions between the trastuzumab glycan variants and immobilized immune receptors generated  (FcγRIa, FcγRIIa H131, FcγRIIa R131, FcγRIIb/c, FcγRIIIa F158, and FcγRIIIa V158) were measured  with a Biacore T200  instrument (GE Healthcare Inc.); procedure described in detail by Thomann et  al. [54].  2.4. Higher‐Order Structure (HOS) Characterization by Hydrogen/Deuterium Exchange‐Mass Spectrometry  (H/DX‐MS)  For structural characterization, the trastuzumab variants were adjusted to 6.6 mg/mL in 10 mM  KH2PO4/K2HPO4 buffer, pH 7.0. H/DX was achieved by 1:20 dilution in 10 mM K2HPO4/KH2PO4/D2O  buffer, pH 7.0, at room temperature. The exchange reaction was quenched by 1:2 dilution with ice‐ cold  100  mM  K2HPO4/KH2PO4,  500  mM  TCEP,  and  4  M  guanidine,  pH  2.4.  The  samples  were  immediately shock frozen on dry ice and stored at −80 °C.  For the targeted H/DX approach, exchange reactions were quenched after 10 min of H/DX. Three  varying combinations, with n = 6 replicates per (glyco‐)variant, were prepared with significant time  intervals  in  between.  Non‐deuterated  reference  samples  of  all  glycan  variants  were  prepared  in  triplicate. For the time course H/DX approach, reactions were quenched after 0.5 min, 1 min, 10 min,  30 min, 1 h, 3 h, and 48 h. Deuterated and non‐deuterated samples were prepared in triplicate.  All samples (of both H/DX approaches) were measured on a Waters nanoAcquity UPLC M‐Class  system with H/DX technology connected to a Waters Synapt G2 HDMS Q‐ToF mass spectrometer.  Each  sample  was  thawed  immediately  prior  to  measurement.  Sample  injection  (55  pmol)  was  performed manually. The coupled 2D‐LC setup operates with online‐digestion at 15 °C; subsequent  trapping was at 0 °C on a Waters Acquity UPLC BEH C18 Van guard pre‐column (1.7 μm, 2.1 × 5.0  mm); and final separation was on a Waters BEH C18 analytical column (1.7 μm, 1 × 100 mm). For  online‐digestion, either an immobilized pepsin/type XIII (NovaBioAssays LLC, Woburn, MA, USA)  or Poroszyme™ pepsin column (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) was used. Back‐ exchange  (i.e.,  deuterium  loss)  was  determined  as  49%  ±  14%  using  the  48  h  labeling  values  as  approximation for 100% exchange. The percentage difference of theoretical and measured deuterium  uptake per peptide, was averaged for the whole IgG sequence. The H/DX data was not corrected for  this deuterium loss, as only the relative levels of deuterium incorporation between the samples have  been compared.  Peptide identification was performed with Waters ProteinLynx Global Server™ 3.0.2. The data  was processed and analyzed with Waters DynamX 3.0.0. Detected charge states were averaged for  the individual peptides. The relative deuterium uptake (average D uptake) per peptide [Da] was  Antibodies 2019, 8, 49  6  of  19  calculated compared  to that of the non‐deuterated samples. Uptake differences between samples  were calculated by subtraction of the corresponding average uptake values. The reduction in H/DX  was calculated by normalization on de‐glycosylated trastuzumab (showing maximum exchange in  affected protein regions and used as a system suitability test for every H/DX‐MS experiment).  3. Results  The  Fc  glycan  variants  were  generated  by  applying  post‐process  enzymatic  engineering  to  trastuzumab  starting  material  (Figure  1).  As  described  recently,  this  IVGE  approach  was  accomplished by the systematic and differential use of commercially available recombinant enzymes  [23]. The Fc glycan distribution was monitored by 2‐AB labeling of the liberated oligosaccharides.  The results are summarized in Table 1.  In detail, a hypo‐galactosylated variant “G0F” (81% G0F), a hyper‐galactosylated variant “G2F”  (83% G2F), and two differentially sialylated variants “ST3” (60% G2S2F) and “ST6” (43% G2S2F) with  α‐2,3‐ or α‐2,6‐linked sialic acids were produced. A variant with significant, high mannose levels  “Man5” (88% Man5) was also generated through the application of the cytotoxin kifunensine during  the  fermentation  processing,  followed  by α‐1,2‐mannosidase  treatment.  In  addition,  a  de‐ glycosylated sample “Degly” was prepared by PNGaseF treatment. Equally treated, but unprocessed  trastuzumab reference material was utilized as a control sample “RM.”  To  assess  structurally  relevant  chemical  and  post‐translational  amino  acid  modifications,  potentially induced by the IVGE sample processing, all samples generated were further evaluated by  LC‐MS/MS peptide mapping (Table 2). The difference in light chain N30 deamidation was quantified  at  a  maximum  variation  of  2.2%  relative  abundance.  The  heavy  chain  D98  isomerization  was  determined  within  3.0%  variance.  The  corresponding  succinimide  formation  was  found  to  vary  within 1.8% relative abundance. More importantly, the oxidation level for the susceptible residue  M252 in the conserved IgG1 region was determined to be equally and only moderately elevated up  to a maximum of 2.6%, for all IVGE samples compared to the trastuzumab reference material. In  summary, no significant alterations for chemical and post‐translational modifications were observed  for the IVGE samples. In addition, the potential formation of antibody fragments and aggregates was  investigated  by  size  exclusion  chromatography  (SEC).  Likewise,  no  alterations  in  distribution  of  molecular weight species compared to the trastuzumab reference material could be detected (Table  3).  The  Fc  glycan  variants  were  further  analyzed  by  a  systematic  structural  and  functional  characterization approach. An optimized targeted H/DX‐MS approach for the detectability of minor  structural changes within a set time range was established, as recently described [43]. An optimal  deuterium  (D)  incubation  time  of  10  min  was  determined  (data  not  shown).  The  2D  LC‐MS/MS  peptide  mapping  (online  pepsin/type  XIII  protease  digestion  and  subsequent  RP  C18  separation)  yielded sequence coverages of 87%–94% and 81%–98% for the non‐deuterated antibody heavy and  light chains, respectively. For each glycan variant over all three data sets was collected, and generated  by two independent operators and with two different digestion columns, corresponding to up to 18  replicates for each sample (Figures 2 and 3).  The visualization of glycan‐induced structural changes was realized by calculation of the relative  deuterium uptake (D uptake) difference in [Da] for the RM sample (Figure 2). This representation is  used here to facilitate identification of trends elicited by the various individual N‐glycans compared  to a “standard” heterogeneous mixture (RM). Most of the changes were seen for the heavy chain Cγ2  domain, but minor changes were for the heavy chain Cγ3 domain, and none were for the light chain  (Figure 2 and Figure S1). The sialylated variants ST3 and ST6, as well as the Degly variant, all showed  less H/DX within the Cγ3 domain region V369‐E380 compared to the RM (Figure 2). The Cγ2 domain  uptake differences were observed for the peptides with amino acids (aa) 235‐240, aa235–241, aa241– 252, aa242‐251, aa242–252, aa243‐252, aa244‐252, aa262‐277, and aa263‐277 (for EU numbering [4] for  shared peptic/type XIII peptides of three targeted experiments, see Table S1). Affected areas are the  A‐strand, the following AB‐helix, the B‐strand, the BC‐loop and the C‐strand of the Cγ2 domain  (Figure 2c–h, structure based on PDB ID code: 5VGP). Three distinct regions with significant uptake  Antibodies 2019, 8, 49  7  of  19  differences  can  be  described:  L235–F241  (hinge/A‐strand),  F241–M252  (A‐strand/AB‐helix),  and  V262–W277 (B‐strand/BC‐loop/C‐strand), graphically illustrated in Figure 3a. No differences could  be detected for the region I253–V262, which contains the intra‐domain disulfide bond between C261  and  C321  [12].  Further,  the  glyco‐peptide  uptake  differences  were  not  determined  between  the  different variants due to the diversity of glycan structures. The varying number of H/D exchanging  acetamido groups on the individual glycans makes it impossible to quantitatively compare peptides  within the C’E‐loop area, i.e., the glycosylation site, as has been described in detail by Guttman et al.  and More et al. [46,55].  Table 1. Relative quantification of 2‐AB labeled (trastuzumab) N‐glycans (2‐AB HILIC).  Fc Glycosylation (%)  Trastuzumab    RM  Man5  G0F  G2F  G2S2F ST3  G2S2F ST6  G0  3.5  3.6  0.5  5.2  0.1  n.q.  0.4  G0F  34.2  39.3  3.4  80.6  n.q.  0.0  0.2  G1  2.8  2.9  1.0  0.1  0.1  0.2  0.7  G1F  41.9  39.0  3.3  1.4  0.4  0.1  0.1  G2  0.4  0.3  0.1  n.q.  5.4  0.5  0.4  G2F  9.3  7.2  0.8  0.7  83.1  1.6  1.8  G2S1  0.1  0.1  n.q.  0.2  n.q.  1.7  3.4  G2S1F  0.9  0.6  0.2  0.2  1.7  13.8  26.5  G2S2  0.1  n.q.  n.q.  n.q.  0.5  3.9  2.8  G2S2F  0.2  0.3  n.q.  0.1  n.q.  60.3  42.9  M3  n.q.  n.q.  0.1  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  M3F  n.q.  n.q.  0.1  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  hM3  0.4  0.6  0.2  1.0  0.0  0.1  0.3  hM3F  0.6  1.2  0.3  2.2  0.0  n.q.  0.2  hM3G1S1  0.1  0.1  n.q.  0.1  0.1  1.9  2.5  hM3G1S1F  0.3  0.4  n.q.  0.6  0.5  4.4  3.7  M4  n.q.  n.q.  0.1  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  hM4  0.3  0.3  n.q.  n.q.  1.0  0.1  1.2  hM4F  0.0  n.q.  n.q.  0.0  2.2  n.q.  n.q.  M5  1.3  1.3  88.3  1.4  1.4  3.1  3.3  hM5  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  M6  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  M7  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  not assigned  3.9  2.8  1.4  6.3  3.5  8.3  9.7   Method reference standard; n.q. = not quantifiable.  In absence of glycan structures, the Cγ2 domain has been repeatedly shown to be susceptible to  H/DX [17,44–46]. Accordingly, Degly incorporated considerably more deuterium than RM (up to Δ‐ 0.9  Da  per  peptide  within  the  Cγ2  regions  L235–M252  and  V262–W277,  see  Table  S1).  The  corresponding uptake differences per peptide were negative, as shown for the RM (Figure 2a–c). As  demonstrated  in  literature  before  [17,19,56–58],  the  Fc  binding  activity  was  found  to  be  almost  completely lost in the absence of the Fc glycan (Figure 4 and Table S2). Only a weak relative binding  activity for the FcγRIa receptor remained (Figure 4a). With an uptake difference of Δ−0.4 Da (L235– M252  and  V262–W277),  the  RM  also  incorporated  less  deuterium  than  the  Man5  sample  (Figure  2a,b,d and Table S1). In contrast, hyper‐galactosylation (G2F) and α‐2,6‐sialylation (ST6) stabilized  and/or shielded the A‐strand and the AB‐helix; i.e., incorporated even less deuterium than the RM  (Figure 2a,b,f,h). In the region F241–M252, the RM exhibited an average uptake difference of Δ0.5 Da,  compared to the G2F variant, and Δ0.6 Da compared to the ST6 sample (Table S1). Interestingly, the  Cγ2 region F241–M252 of the ST3 variant did not reveal uptake differences relative to the RM (Figure  2a,b,g). Uptake differences of Δ‐0.3 and Δ‐0.4 Da were calculated for the other two regions L235–F241  and V262–W277, respectively. Further, the trastuzumab RM exhibited an uptake difference of Δ‐0.3  Da within the A‐strand/AB‐helix (aa241–252) compared with the G0F variant.  Antibodies 2019, 8, 49  8  of  19  Table 2. Relative quantification of chemical amino acid modifications (LC‐MS peptide mapping).  Chemical Mod. (%)  Trastuzumab    RM  Degly  Man5  G0F  G2F  G2S2F ST3  G2S2F ST6  LC N30   deamidation  9.6  8.7  10.9  9.1  9.1  9.0  9.6  10.0  LC N30   succinimide  0.6  0.7  0.7  0.6  0.8  0.7  1.1  1.1  HC N54   deamidation  1.5  1.6  1.7  2.2  1.7  2.0  1.8  1.6  HC N54   succinimide  3.9  4.0  3.9  4.1  3.9  3.9  3.7  3.8  HC D98   isomerization  7.7  7.6  8.0  10.0  7.0  7.7  7.9  8.7  HC D98   succinimide  3.5  4.1  3.6  2.5  4.3  3.8  4.3  4.3  HC N389/390   deam.  2.0  1.9  2.2  1.6  1.9  1.9  2.1  2.0  HC N389/390   succ.  1.7  1.7  1.7  2.0  1.8  1.7  1.8  1.8  HC M252   oxidation  2.3  2.6  3.4  5.2  3.0  3.8  3.8  3.8  1 2 3  Method reference standard;   Kabat numbering [59];   EU numbering [4].  Table 3. Relative quantification of trastuzumab size variants (SEC‐UV).  Mol. Weight Species (%)  Trastuzumab    RM  Degly  Man5  G0F  G2F  G2S2F ST3  G2S2F ST6  Monomer  99.8  99.6  99.6  99.4  99.6  99.3  99.2  99.1  total HMW    0.2  0.4  0.4  0.5  0.3  0.7  0.8  0.9  total LMW    0.0  0.0  0.1  0.1  0.1  0.0  0.0  0.1  1 2 3  Method reference standard;   high molecular weight species;   low molecular weight species.  The  data  are  presented  in  Figure  3a–d  alternatively,  normalized  with  the  de‐glycosylated  trastuzumab  sample.  The  reduction  in  H/DX  was  calculated,  as  correlated  with  the  successive  structural extension of the Fc glycan. Several peptides for the three distinct regions are shown. For  the RM, the H/DX of the representative peptide aa235–241 was reduced by 38% ± 2% (Figure 3a and  Table S1). The representative peptides aa241–252 and aa262–277 showed 26% ± 2% and 20% ± 1%  reductions, respectively. With an 18% ± 4% reduction in H/DX, the hypo‐galactosylated G0F variant  was  found  to  exhibit  slightly  lower  values  for  the  aa241–252  peptide  (Figure  3a  and  Table  S1).  Accordingly,  the  G0F  sample  revealed  a  similar  relative  binding  activity  for  FcγRI‐III  receptors  compared to the RM (Figure 4b–f). For the Man5 sample, a significantly lower H/DX reduction of  13% ± 1% for the aa241–252 peptide was observed. An equivalent offset could be observed for the  Man5 Cγ2 BC‐loop area V262–W277, with an 11% ± 1% (versus 20% ± 1% for the RM) reduction in  H/DX, and an even more significant shift for the hinge/A‐strand segment, including residues L235– F241 with a 19% ± 1% (versus 38% ± 2% for the RM) reduction in H/DX (Figure 3b).  As stated earlier,  the hyper‐galactosylated G2F variant was  found to be less prone  to H/DX  within its Cγ2 domain (41% ± 1% versus 26 ± 2% (RM) reduction in H/DX for aa241–252). This is in  contrast to the hypo‐galactosylated G0F and high mannose Man5 variants. The presence of galactoses  appears to reduce the exchange of amide‐bound hydrogens within the Cγ2 A‐strand/AB‐helix region  (Figure 3a,c). The sialylated ST6 variant exhibits even further diminished Cγ2 dynamics/accessibility  (49% ± 3% reduction in H/DX for the aa241–252 peptide; Figure 3a,d). Correspondingly, the G2F and  ST6 variants also revealed different relative binding activities for FcγR receptors (Figure 4). In detail,  the binding affinity to the FcγRIIIa (V158 and F158) was found to be enhanced for the G2F variant  (120% ± 1% and 124% ± 1%; see Table S2). In addition, the ST6 variant showed increased binding  activity for the FcγRIIa R131 (130% ± 2%), FcγRIIa H131 (120% ± 1%), FcγRIIb/c (162% ± 4%), FcγRIIIa  V158 (121% ± 1%), and the FcγRIIIa F158 (150% ± 1%) compared to the trastuzumab starting material  (Table S2, Figure 4b–f).  Antibodies 2019, 8, 49  9  of  19  Figure 2. Average deuterium (D) uptake differences (Da) of trastuzumab reference material (RM) and  glyco‐engineered trastuzumab variants (n = 6) after 10 min of H/DX. (a) Differential heat map and (b)  uptake plot of (shared) trastuzumab heavy chain peptides, resulting from pepsin/type XIII digestion  (sequence coverage 87%–94%). (c–h) Differential D, uptake as established in (a) and projected onto Fc  crystal structures based on PDB ID code 5VGP: (c) “Degly”, (d) “Man5”, (e) “G0F”, (f) “G2F”, (g)  “ST3”, and (h) “ST6”.  Interestingly, the α‐2,3‐linked G2S2F variant (ST3) revealed an opposite trend for H/DX and  FcγR receptor binding activity compared to the ST6 variant. The regions L235–F241 and V262–W277  showed 27% ± 2% (versus 38 ± 2% for the RM) and 11% ± 1% (versus 20 ± 1% for the RM) reductions  in H/DX. With a 27% ± 3% reduction in H/DX, the area including the A‐strand and flanking the AB‐ Antibodies 2019, 8, 49  10  of  19  helix  (F241–M252)  exhibited  a  similar  exchange  behavior  as  observed  for  the  RM  (Figure  3a).  Accordingly, the  ST3 sample revealed reduced binding affinity (up to around 40%)  to the  tested  FcγIIa/b/c  and  FcγRIIIa  receptors  (Figure  4b–f),  but  had  no  significant  effect  on  FcγRIa  binding  (Figure 4a). Most severely, the FcγRIIIa F158 interaction was found to be impaired, with 62% ± 1%  relative binding (Figure 4e).  We further analyzed the observed differences in H/DX and corresponding binding affinities for  Fcγ  receptors  between  the  ST3  and  ST6  variants  by  an  expanded  H/DX  approach  (time  course  experiment).  The  differences  in  H/DX  between  the α‐2,3  and  the α‐2,6‐sialylated  trastuzumab  variants  observed  at  10  min  deuterium  incubation  time  (Figure  3d)  could  be  verified  for  the  additional time points investigated (0.5 min, 1 min, 10 min, 30 min, 1 h, 3 h, and 48 h), as shown in  Figure  5.  Sequence  coverages  of  88%  for  both  the  heavy  and  the  light  chains  were  achieved.  As  illustrated in Figure 5, the two G2S2F variants revealed significant uptake differences for the heavy  chain Cγ2 domain regions L235–M252, V262–W277, and Y278‐N325 (no changes were seen for the  light chain as shown in Figure S2). The respective values and peptic/type XIII peptides are listed in  the Supplementary Table S3. The three regions of varying D uptake also revealed differences in the  exchange rates (Figure 5a). The corresponding relative D uptake curves are depicted in Figure 5b–u.  For the residues L235–M252, the maximum D uptake difference between the two sialic acid variants  was already reached after 10 min (Figure 5c–j). With an uptake difference of Δ0.3 Da for the aa235– 241 and Δ0.6 Da for the aa242–252 peptides, the ST3 variant exchanged more hydrogen than the α‐ 2,6‐linked ST6 variant in this region (Figure 5d,g and Table S3). Notably, only the peptide aa235–241  exhibited further H/D exchange beyond 60 min in this region (Figure 5d). The area V262–W277 (e.g.,  aa263–275) followed an overall faster exchange rate, but the uptake difference maximum appeared  later  (after  60  min  with  maximum Δ0.7  Da  uptake  difference;  see  Figure  5l  and  Table  S3).  This  explains the overall lower H/DX differences observed in the preceding 10 min targeted approach for  that sequence area (V262–W277), as shown in Figure 3a. The uptake difference maximum for the  glycosylated region Y278–N325 (C‐strand to FG‐loop) was reached even more rapidly (Figure 5a).  Comparison  of  the  doubly  sialylated glyco‐peptide  revealed more  D  uptake  within  the  C’E‐loop  (E294‐R301) for several ST3 variant peptides within the region (Figure 5o–t). In detail, maximum  uptake differences compared to the ST6 variant were observed already after 1 min; e.g., with Δ2.6 Da  for the  peptide aa278–305 (Figure 5p).  We further found  that amino acid regions adjacent to  the  glycosylation site showed slow H/D exchange rates at incubation times <60 min. As visible for the  heavy chain peptide aa301–306 (Figure 5u), a significant exchange difference can only be detected  after 3 h (Δ0.2 Da) and 48 h (Δ0.5 Da). Together, this indicates that the α‐2,3‐linkage impacts the  glycan  dynamics  more  significantly,  resulting  in  an  increased  motion  of  the  Cγ2  C’E‐loop  area  compared to the α‐2,6‐linkage.  Overall, the time course data identifies the 10 min deuterium incubation time, selected for the  targeted H/DX experiments, as suitable for the detection of H/DX differences caused by different N‐ glycosylations. Moreover, the structural observations for ST3 versus ST6 are in close agreement with  the differential binding activities for FcγR receptors, as probed by SPR (Figure 4).  Antibodies 2019, 8, 49  11  of  19  Figure 3. Reduction in H/DX (%) of trastuzumab glycan variant Cγ2 domain peptides, resulting from  pepsin  or  pepsin/type  XIII  digestion  (sequence  coverage  87%–94%),  normalized  with  the  de‐ glycosylated  trastuzumab  sample.  (a)  Single  peptide  values  of  three  targeted  (10  min  H/DX)  experiments with trastuzumab Man5 (light blue), G0F (green), RM (black), ST3 (red), G2F (gray), and  ST6 (orange). (b–d) Box plots with single peptide values of single experiments (n = 6) and representing  boxes showing minimum, 25th percentile, median, 75th percentile, and maximum values. Additional  statistical significance testing was as recently described by Hagemann et al.; see Figure S3 [60].  1  Figure  4.  (a–f)  Relative  FcγR  binding  (%)  of  trastuzumab  (glyco‐)variants,  as  normalized  with  trastuzumab starting material. Binding affinities were measured by surface plasmon resonance (SPR)  technology; n = 3.  Antibodies 2019, 8, 49  12  of  19  Figure 5. D uptake (Da) of differentially sialylated trastuzumab glycan variants (n = 3). Shown are  heavy chain peptides, as obtained by pepsin/type XIII digestion (sequence coverage 88%). (a) Uptake  difference plot of H/DX time course experiment performed for 0.5 min (pink), 1 min (light blue), 10  min (orange), 30 min (green), 1 h (red), 3 h (purple), and 48 h (black). (b–u) Relative uptake curves of  individual peptides, as summarized in (a).  Antibodies 2019, 8, 49  13  of  19  4. Discussion  Many studies correlating structural observations with the effector function of IgGs have been  published [61]. The idea of passive functional regulation through the Fc‐glycan structure has already  been shaped [8,11,13,17]. The present study aims at the systematic comparison of common N‐glycan  variants. By means of in vitro glyco‐engineering (IVGE), highly comparable samples, varying only  through their defined glycan structure, were generated (Figure 1) [23]. Compared to trastuzumab  starting material, no substantial chemical modifications or structural degradations of the primary  structure were found to be induced by the enzymatic treatment (Tables 2 and 3).  We recently presented a targeted H/DX‐MS approach to monitor minor structural alterations,  wherein  reliable  assignments  of  H/DX  differences  resulting  from  methionine  oxidation  were  demonstrated. M252‐ox levels to <5% could be differentiated, and as such, the impact of methionine  oxidation cannot be excluded here entirely [43]. However, no correlation between the oxidation levels  and the D uptake trends observed here could be established. The H/DX‐MS approach described was  utilized  here  to  compare  overall  seven  glyco‐variants.  After  10  min  of  deuterium  incubation,  significant uptake differences could be attributed to the individual glycan structures (Figure 2). We  merged three internally normalized data sets for direct comparison and were able to demonstrate  high method robustness (Figure 3).  Whereas no exchange differences could be established for the antibody light chain (Figure S1)  or Fab part of the heavy chain, five regions exhibiting differential uptake were identified in the heavy  chain Fc part (including the C’E loop area, which could only be analyzed for equal glycosylations).  Minor changes could be determined for the Cγ3 domain, with the BC‐loop region VKGFYPSDIAVE  (aa369–380) of the de‐glycosylated and both sialylated variants incorporating slightly less deuterium  than the RM (Figure 2a). Differential H/DX in this region has not previously been described in the  literature. However, the main uptake differences observed here were within the Cγ2 domain, which  is  consistent  with  previous  reports  investigating  antibody  glyco‐variants  [17,21,44–46].  The  Cγ2  domain  regions  revealing  differential  uptake  with  our  glyco‐variant  panel  correspond  to  the  A‐ strand, AB‐helix, B‐strand, and BC‐loop (Figure 2c–h and Figure 3a). Specifically, the domain regions  LGGPSVF  (aa235–241),  FLFPPKPKDTLM  (aa241–252)  and  VVVDVSHEDPEVKFNW  (aa262–277)  showed  differential  exchange,  confirmed  by  overlapping  peptides  (Figure  3a).  Since  the  peptide  aa266–277 exhibited no significant exchange differences, the differences observed for the peptide  aa262–277 can be attributed to its VVVD segment (V262–D265) by subtraction.  H/DX differences upon de‐glycosylation have been extensively investigated, with the region  L235–M252  described  [44,45].  Subsequent  loss  of  the  antibody  effector  function  has  also  been  observed for fully glycan truncated Fc [17,19,56–58]. Our data confirms this, with de‐glycosylated  trastuzumab incorporating more deuterium in the regions L235–F241, F241–M252 and V262–D265  (Figure 2) and showing loss of effector function (Figure 4).  Fang  et  al.  reported  increased  D  uptake  for  IgG2  high  mannose  variants  compared  with  heterogeneous glycan samples (~60% G0F, ~30% G1F, and ~4% G2F). They identified the peptides  F241–M252 and V263–F275, which correspond to our peptides FLFPPKPKDTLM (aa241–252) and  VVDVSHEDPEVKFNW  (aa263–277),  shown  in  Figure  3a  [21].  The  results  from  More  et  al.  augmented these findings and also showed uptake differences for the hinge‐Cγ2 interface and Cγ3  domain peptides, in their comparison of IgG1 de‐glycosylated, GlcNAc, and Man5 variants with high  mannose (Man5‐Man9) material [46]. We generated a sample with ~90% Fc Man5 and demonstrated  increased deuterium incorporation compared to the isolated G0F, G2F, and G2S2F variants, and the  heterogeneous  RM  fraction  in  the  areas  described  by  Fang  and  colleagues  (Figure  3a–b)  [21].  Furthermore, we demonstrate an increased D uptake for the peptide LGGPSVF (aa235–241), an area  described to have differential uptake behavior by More et al. 2018 [46]. A functional correlation with  fucosylated high mannose mAb has not been reported in the literature and was also not addressed  in our study. The previously reported increase in FcγRIII binding and in vitro ADCC has only been  demonstrated for afucosylated high mannose variants [62–64]. Our data suggests no relevant fucose‐ initiated interactions to be determining for the Fc dynamics, thus pre‐defining an optimal binding  interface for FcγR interaction. This supports the concept of steric hindrance by the core fucose during  Antibodies 2019, 8, 49  14  of  19  FcγRIIIa interaction [3]. Moreover, an increase in serum clearance of high mannose variants has been  reported  [65].  HD/X  interaction  studies  with  mannose  receptors,  FcRn  and  FcγR,  could  provide  further clarification on this topic.  The H/D exchange behavior of our enriched G0F sample (~80% G0F) was quite comparable to  trastuzumab RM (~40% G0F, ~40% G1F, and ~10% G2F) although it did show slightly more D uptake;  i.e.,  less  reduction  in  H/DX  (Figure  3a).  This  appears  to  be  reasonable  in  light  of  the  decreased  exchange observed for the trastuzumab G2F variant (Figure 3c). G2F (~85% G2F) with two additional  galactose units, showed significantly less deuterium incorporation for the region FLFPPKPKDTLM  (aa241–252), plus significantly enhanced FcγRIIIa binding (Figure 4e–f). These findings are consistent  with previous studies. Houde et al. reported the same peptide to exchange more hydrogen upon  galactosylation [17]. Due to peptic peptide overlaps, they were able to assign the increased H/DX to  the backbone amides of the residues L243, F244, and K247 (according to EU numbering [4]: L242,  F243, and K246). Further they reported a strong increase in relative binding to FcγRIIIa upon hyper‐ galactosylation. Krapp et al. also describe a stable GlcNAc–F241 interaction [11]. Our data conforms  both of those proposed interactions, with an uptake difference between G0F and G2F for aa241–252  but  not  for  aa235–241  (Figure  3c).  Subedi  et  al.  further  reported  that  F241/F243  mutations  were  impaired FcγR binding exclusively in the presence of terminal galactoses [9]. A potential explanation  is that α‐1,6‐arm Gal preferentially interacts with F241/243. The glycan α‐1,6‐arm is described to be  critical for protein surface contacts and has been simulated to adopt a “foldover” conformation upon  galactosylation, whilst the α‐1,3‐arm extends between the Cγ2 domains in an “outstretched” and  more rigid fashion [8,20,35].  We further present two highly sialylated but distinct trastuzumab glyco‐variants comprised of  ~60% α‐2,3‐linked G2S2F (ST3) or ~40% α‐2,6‐linked G2S2F (ST6), as the main component (Table 1).  The  ST6  variant  showed  relatively  comparable  H/DX  behavior  to  the  G2F  variant,  revealing,  however, the overall least exchange of all glycan variants investigated (Figure 3a). In parallel, the ST6  variant exhibited the highest binding activity in most of the functional assays (Figure 4b–e). No effect  of  terminal  sialic  acids  on  the  binding  affinity  to  Fcγ  receptors  has  been  reported  [23,26,33,34].  Further, the association of overall decreasing Cγ2 stability with decreasing glycan size [11,15,46] is in  contrast  to  results  presented  by  Ahmed  et  al.  2014  for  the α‐2,6  variant  investigated  [30].  The  comparative results of the ST6 variant in our results indicate a positive correlation between stability  of the Cγ2 region, as reflected by reduced H/DX, and enhanced functional activity. The differential  exchange for the aa241–252 peptide between G2F and ST6 (Figure 3a) further supports the concept of  dynamic modulation by differential glycan–protein and glycan–glycan interactions. In addition, an  enhanced ADCC activity for the α‐2,6‐sialylated G2S2F variant has been reported the most recently  [54].  The  finding  of  decreased  H/DX  for  doubly α‐2,6‐sialylated  Fc  glycan  structures  has  not  previously been described in literature and potentially throws a new light on the subject matter of  anti‐inflammatory IVIGs [66]. Our results indicate that the Cγ2 (and Cγ3) dynamics are not the only  determining factor for specific and functional‐defining interactions, as proposed for anti and pro‐ inflammatory effector functions, and consistent with previous work associating the lack of fucose  with subsequently closer carbohydrate contacts [3,67]. Potentially, the sialic acid itself plays a crucial  role in anti‐inflammatory receptor binding, as observed for the SIGN‐R1 [28].  For the α‐2,3‐linked sialic acid variant, D uptake differences could be observed for all of the  aforementioned Cγ2 domain areas L235–F241, F241–M252, and V262–W277 (Figure 5c–m). While the  peptide FLFPPKPKDTLM (aa241–252) showed an H/DX comparable to the mixed fraction RM, the  peptides  LGGPSVF  (aa235–241)  and  the  VVVD  (aa262–265)  segment  showed  more  exchange  compared to the RM (Figure 3a). The kind of linkage, therefore, can be shown to affect the H/DX  kinetics. This trend was able to be further confirmed within an H/DX time survey (Figure 5a). The  described areas exchanged relatively slowly (maximum H/DX difference about 10–30 min). Faster  backbone  hydrogen  exchange  was  observed  for  the  additional  glyco‐peptide  region  Y278–N325  (maximum  H/DX  difference  ~1  min);  e.g.,  for  the  peptide  VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL  (aa282–306) shown in Figure 5r. Very likely, the uptake is favored by the seven accessible acetamido  groups of the G2S2F structure. However, the differential uptake of the glycan itself already reveals  Antibodies 2019, 8, 49  15  of  19  information about the glycan–glycan and glycan–protein interactions. We propose the α‐2,6‐structure  is more shielded, due to (H‐bonding) interactions (less H/DX), compared to the α‐2,3‐structure (more  H/DX). The H/DX of the amide backbone of the C’E‐loop peptides and the attached glycan structures  cannot be differentiated. However, the large D uptake difference for the overall peptide does indicate  an increased motion of the C’E‐loop area for the α‐2,3‐linked G2S2F variant, which is proposed to  determine the FcγR binding interface [5,11,13]. This would explain differential receptor interactions  described for differentially linked sialic acids; e.g., for the CD22 binding [68]. Moreover, Anthony et  al. recognized that IgG Fc α‐2,3‐linked sialic acid structures did not exhibit an anti‐inflammatory  potential [28,66]. This also correlates well with observations made by Falck and colleagues who report  α‐2,3‐linked G2S1F IgG to be significantly more susceptible to tryptic digestion than α‐2,6‐linked  G2S1F IVIGs [69]. The levels of the corresponding singly sialylated molecules in our samples were  ~14% G2S1F (ST3) and ~27% G2S1F (ST6), respectively. In accordance with reports on differential  sialylation of the bi‐antennary glycan arms [70], we obtained about twice as much singly sialylated  molecules for the α‐2,6‐linked variant compared to the α‐2,3‐linked version. A possible explanation  could be an increased accessibility for the α‐2,3‐sialyltransferase due to decreased interaction of the  ST3  glycan  structure  (predominantly  the α‐1,6‐arm)  with  the  protein  surface.  Indeed,  our  H/DX  results support this assumption. The differing ratio of G2S1F/G2S2F for the two differentially linked  sialic acid samples should also be considered in context of the observed results. With less conjugated  sialic acids, more galactoses would be accessible to interact with the protein surface. In a recently  published in silico study, Harbison et al. were able to show increased conformational freedom for α‐ 2,6‐linkages,  as  shown  for  an  isolated  G2S2F  glycan  structure  [35].  Our  results  suggest  (steric)  hindrance of galactose interactions with the protein surface by the comparably short O‐glycosidic  linkage of the galactose C3 hydroxy‐group and the sialic acid, e.g., the Gal interaction with K246 as  presented by Houde et al. 2010. In contrast, the O‐glycosidic linkage between the C6 hydroxymethyl‐ group (CH2OH) and the sialic acid protrudes out of the cyclic hexose conformation, which would  yield a higher conformational degree of freedom [35].  5. Conclusions  Here, we present a combined approach of in vitro glyco‐engineering and H/DX‐MS to assess the  impact of Fc glycosylation on higher‐order structure (HOS). We were able to confirm significantly  distinguishable  uptake  trends  towards  lower  exchange  rates  for  larger  glycan  structures.  As  an  exception we found the G2S2F structure with terminal α‐2,3‐linked sialic acids to incorporate more  deuterium  compared  to  the α‐2,6‐linked  sialic  acid  structure.  A  strong  structure  to  function  correlation between the H/DX and SPR data could be verified and highlights the important role of  the terminal sialic acid linkage. As indicated by our results and as already suggested in other studies,  the antibody backbone dynamics are most likely stabilized due to inter‐glycan and glycan–protein  interactions.  Proposed  is  an  overall  entropic  modulation  towards  an  optimal  binding  interface.  Described factors are the Cγ2 domain orientation and site‐specific interactions, whereof the former  is suggested to depend on the inter‐glycan interactions and the latter on glycan–protein interactions.  A key role has been ascribed to the fluctuation of the C’E‐loop. Its motion supposedly depends on  the Cγ2 dynamics and is again determined by certain secondary structure events.  Our results support this assumption. With more interactions favored by the individual structure,  the overall backbone motion/accessibility decreases. The interactions facilitated by sialic acids and  the mechanism for domain destabilization caused by the α‐2,3‐linkage of the terminal sugar should  be further experimentally addressed. Our results show there is no strict correlation between Fc glycan  size and resulting Cγ2 flexibility, with linkage, and hence, steric factors also contributing.  Supplementary Materials: The following are available online at www.mdpi.com/, Figure S1: Reduction in H/DX  (%) of trastuzumab glycan variant peptides (whole sequence); Figure S2: Uptake difference plot with D uptake  (Da) of alternatively linked trastuzumab sialylation variants (light chain only); Figure S3: Volcano plot showing  statistical significance testing of trastuzumab ST3 and ST6 D uptake differences; Table S1: D uptake differences  and reduction in H/DX values; Table S2: Relative FcγR binding of trastuzumab glycan variants; Table S3: D  uptake differences of trastuzumab G2S2F ST3 versus ST6.  Antibodies 2019, 8, 49  16  of  19  Author Contributions: Conceptualization, F.K., M.M., and P.B.; data curation, F.K.; formal analysis, F.K. and  F.C.; investigation, F.K., L.B., S.M., C.A., and H.W.; methodology, F.K., L.B., S.M., M.T., C.A., F.C., and D.R.;  project  administration,  H.W.  and  P.B.;  resources,  H.W.  and  D.R.;  supervision,  L.B.,  M.T.,  M.M.,  and  P.B.;  visualization, F.K.; writing—original draft, F.K.; writing—review and editing, L.B., M.M., and P.B.  Funding: This research received no external funding.  Acknowledgments: We are grateful to Cornelia Wagner and Hubert Kettenberger of Roche Pharma Research  and  Early  Development  (pRED)  for  sharing  their  scientific  and  technical  knowledge  on  H/DX  and  MD  respectively; Florian Seefried for data analysis support; Christian Goesswald for glycan quantification; and all  members of the laboratories at Roche Penzberg (Germany) for their general assistance and cooperation.  Conflicts of Interest: F.K., L.B., S.M., M.T., H.W., D.R. and P.B. are employees of Roche Diagnostics GmbH; C.A.,  F.C. and H.W. are employees of F. Hoffmann‐La Roche Ltd. The authors declare no conflict of interest.  References  1. Beck, A.; Reichert, J.M. Marketing approval of mogamulizumab: A triumph for glyco‐engineering. MAbs  2012, 4, 419–425.  2. Shields, R.L.; Lai, J.; Keck, R.; O’Connell, L.Y.; Hong, K.; Meng, Y.G.; Weikert, S.H.; Presta, L.G. Lack of  fucose on human igg1 n‐linked oligosaccharide improves binding to human fcgamma riii and antibody‐ dependent cellular toxicity. J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733–26740.  3. Ferrara, C.; Grau, S.; Jager, C.; Sondermann, P.; Brunker, P.; Waldhauer, I.; Hennig, M.; Ruf, A.; Rufer, A.C.;  Stihle,  M.;  et  al.  Unique  carbohydrate‐carbohydrate  interactions  are  required  for  high  affinity  binding  between fcgammariii and antibodies lacking core fucose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 12669–12674.  4. Edelman, G.M.; Cunningham, B.A.; Gall, W.E.; Gottlieb, P.D.; Rutishauser, U.; Waxdal, M.J. The covalent  structure of an entire gammag immunoglobulin molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1969, 63, 78–85.  5. Sondermann,  P.;  Huber,  R.;  Oosthuizen,  V.;  Jacob,  U.  The  3.2‐a  crystal  structure  of  the  human  igg1  fc  fragment‐fc gammariii complex. Nature 2000, 406, 267–273.  6. Barb, A.W.; Meng, L.; Gao, Z.; Johnson, R.W.; Moremen, K.W.; Prestegard, J.H. Nmr characterization of  immunoglobulin g fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry 2012, 51, 4618–4626.  7. Radaev, S.; Motyka, S.; Fridman, W.H.; Sautes‐Fridman, C.; Sun, P.D. The structure of a human type iii  fcgamma receptor in complex with fc. J. Biol. Chem. 2001, 276, 16469–16477.  8. Frank,  M.;  Walker,  R.C.;  Lanzilotta,  W.N.;  Prestegard,  J.H.;  Barb,  A.W.  Immunoglobulin  g1  fc  domain  motions: Implications for fc engineering. J. Mol. Biol. 2014, 426, 1799–1811.  9. Subedi, G.P.; Hanson, Q.M.; Barb, A.W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin g1 n‐glycan  is essential for efficient fcgammariiia binding. Structure 2014, 22, 1478–1488.  10. Yu,  X.;  Baruah,  K.;  Harvey,  D.J.;  Vasiljevic,  S.;  Alonzi,  D.S.;  Song,  B.D.;  Higgins,  M.K.;  Bowden,  T.A.;  Scanlan,  C.N.;  Crispin,  M.  Engineering  hydrophobic  protein‐carbohydrate  interactions  to  fine‐tune  monoclonal antibodies. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 9723–9732.  11. Krapp,  S.;  Mimura,  Y.;  Jefferis,  R.;  Huber,  R.;  Sondermann,  P.  Structural  analysis  of  human  igg‐fc  glycoforms reveals a correlation between glycosylation and structural integrity. J. Mol. Biol. 2003, 325, 979– 989.  12. Feige, M.J.; Nath, S.; Catharino, S.R.; Weinfurtner, D.; Steinbacher, S.; Buchner, J. Structure of the murine  unglycosylated igg1 fc fragment. J. Mol. Biol. 2009, 391, 599–608.  13. Subedi, G.P.; Barb, A.W. The structural role of antibody n‐glycosylation in receptor interactions. Structure  2015, 23, 1573–1583.  14. Mimura, Y.; Church, S.; Ghirlando, R.; Ashton, P.R.; Dong, S.; Goodall, M.; Lund, J.; Jefferis, R. The influence  of glycosylation on the thermal stability and effector function expression of human igg1‐fc: Properties of a  series of truncated glycoforms. Mol. Immunol. 2000, 37, 697–706.  15. Buck, P.M.; Kumar, S.; Singh, S.K. Consequences of glycan truncation on fc structural integrity. MAbs 2013,  5, 904–916.  16. Deisenhofer, J. Crystallographic refinement and atomic models of a human fc fragment and its complex  with fragment b of protein a from staphylococcus aureus at 2.9‐ and 2.8‐a resolution. Biochemistry 1981, 20,  2361–2370.  17. Houde, D.; Peng, Y.; Berkowitz, S.A.; Engen, J.R. Post‐translational modifications differentially affect igg1  conformation and receptor binding. Mol. Cell. Proteom. 2010, 9, 1716–1728.  Antibodies 2019, 8, 49  17  of  19  18. Yamaguchi,  Y.;  Nishimura,  M.;  Nagano,  M.;  Yagi,  H.;  Sasakawa,  H.;  Uchida,  K.;  Shitara,  K.;  Kato,  K.  Glycoform‐dependent conformational alteration of the fc region of human immunoglobulin g1 as revealed  by nmr spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1760, 693–700.  19. Lund,  J.;  Tanaka,  T.;  Takahashi,  N.;  Sarmay,  G.;  Arata,  Y.;  Jefferis,  R.  A  protein  structural  change  in  aglycosylated igg3 correlates with loss of hufc gamma r1 and hufc gamma r111 binding and/or activation.  Mol. Immunol. 1990, 27, 1145–1153.  20. Wormald,  M.R.;  Rudd,  P.M.;  Harvey,  D.J.;  Chang,  S.C.;  Scragg,  I.G.;  Dwek,  R.A.  Variations  in  oligosaccharide‐protein interactions in immunoglobulin g determine the site‐specific glycosylation profiles  and modulate the dynamic motion of the fc oligosaccharides. Biochemistry 1997, 36, 1370–1380.  21. Fang, J.; Richardson, J.; Du, Z.; Zhang, Z. Effect of fc‐glycan structure on the conformational stability of igg  revealed by hydrogen/deuterium exchange and limited proteolysis. Biochemistry 2016, 55, 860–868.  22. Thomann, M.; Reckermann, K.; Reusch, D.; Prasser, J.; Tejada, M.L. Fc‐galactosylation modulates antibody‐ dependent cellular cytotoxicity of therapeutic antibodies. Mol. Immunol. 2016, 73, 69–75.  23. Thomann, M.; Schlothauer, T.; Dashivets, T.; Malik, S.; Avenal, C.; Bulau, P.; Ruger, P.; Reusch, D. In vitro  glycoengineering  of  igg1  and  its  effect  on  fc  receptor  binding  and  adcc  activity.  PLoS  ONE  2015,  10,  e0134949.  24. Parekh,  R.B.;  Dwek,  R.A.;  Sutton,  B.J.;  Fernandes,  D.L.;  Leung,  A.;  Stanworth,  D.;  Rademacher,  T.W.;  Mizuochi,  T.;  Taniguchi,  T.;  Matsuta,  K.;  et  al.  Association  of  rheumatoid  arthritis  and  primary  osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum igg. Nature 1985, 316, 452–457.  25. Nimmerjahn,  F.;  Ravetch,  J.V.  Anti‐inflammatory  actions  of  intravenous  immunoglobulin.  Annu.  Rev.  Immunol. 2008, 26, 513–533.  26. Kaneko, Y.; Nimmerjahn, F.; Ravetch, J.V. Anti‐inflammatory activity of immunoglobulin g resulting from  fc sialylation. Science 2006, 313, 670–673.  27. Anthony, R.M.; Ravetch, J.V. A novel role for the igg fc glycan: The anti‐inflammatory activity of sialylated  igg fcs. J. Clin. Immunol. 2010, 30 (Suppl. S1), S9–S14.  28. Anthony, R.M.; Wermeling, F.; Karlsson, M.C.; Ravetch, J.V. Identification of a receptor required for the  anti‐inflammatory activity of ivig. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105, 19571–19578.  29. Arnold,  J.N.;  Wormald,  M.R.;  Sim,  R.B.;  Rudd,  P.M.;  Dwek,  R.A.  The  impact  of  glycosylation  on  the  biological function and structure of human immunoglobulins. Annu. Rev. Immunol. 2007, 25, 21–50.  30. Ahmed, A.A.; Giddens, J.; Pincetic, A.; Lomino, J.V.; Ravetch, J.V.; Wang, L.X.; Bjorkman, P.J. Structural  characterization of anti‐inflammatory immunoglobulin g fc proteins. J. Mol. Biol. 2014, 426, 3166–3179.  31. Scallon,  B.J.;  Tam,  S.H.;  McCarthy,  S.G.;  Cai,  A.N.;  Raju,  T.S.  Higher  levels  of  sialylated  fc  glycans  in  immunoglobulin g molecules can adversely impact functionality. Mol. Immunol. 2007, 44, 1524–1534.  32. Naso, M.F.; Tam, S.H.; Scallon, B.J.; Raju, T.S. Engineering host cell lines to reduce terminal sialylation of  secreted antibodies. MAbs 2010, 2, 519–527.  33. Kapur,  R.;  Einarsdottir,  H.K.;  Vidarsson,  G.  Igg‐effector  functions:  “The  good,  the  bad  and  the  ugly”.  Immunol. Lett. 2014, 160, 139–144.  34. Stadlmann, J.;  Pabst,  M.;  Altmann, F.  Analytical  and functional  aspects  of antibody  sialylation.  J.  Clin.  Immunol. 2010, 30 (Suppl. S1), S15–S19.  35. Harbison, A.M.; Brosnan, L.P.; Fenlon, K.; Fadda, E. Sequence‐to‐structure dependence of isolated igg fc  complex biantennary n‐glycans: A molecular dynamics study. Glycobiology 2019, 29, 94–103.  36. Konermann,  L.;  Tong,  X.;  Pan,  Y.  Protein  structure  and  dynamics  studied  by  mass  spectrometry:  H/d  exchange, hydroxyl radical labeling, and related approaches. J. Mass Spectrom. 2008, 43, 1021–1036.  37. Houde, D.; Berkowitz, S.A.; Engen, J.R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in  biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 2011, 100, 2071–2086.  38. Huang,  R.Y.;  Chen,  G.  Higher  order  structure  characterization  of  protein  therapeutics  by  hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2014, 406, 6541–6558.  39. Burkitt,  W.;  Domann,  P.;  O’Connor,  G.  Conformational  changes  in  oxidatively  stressed  monoclonal  antibodies studied by hydrogen exchange mass spectrometry. Protein Sci. 2010, 19, 826–835.  40. Zhang, A.; Hu, P.; MacGregor, P.; Xue, Y.; Fan, H.; Suchecki, P.; Olszewski, L.; Liu, A. Understanding the  conformational  impact  of  chemical  modifications  on  monoclonal  antibodies  with  diverse  sequence  variation using hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry and structural modeling. Anal. Chem.  2014, 86, 3468–3475.  Antibodies 2019, 8, 49  18  of  19  41. Mo, J.; Yan, Q.; So, C.K.; Soden, T.; Lewis, M.J.; Hu, P. Understanding the impact of methionine oxidation  on the biological functions of igg1 antibodies using hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.  Anal. Chem. 2016, 88, 9495–9502.  42. Yan, Y.; Wei, H.; Fu, Y.; Jusuf, S.; Zeng, M.;  Ludwig, R.; Krystek, S.R., Jr.; Chen, G.; Tao,  L.; Das,  T.K.  Isomerization and oxidation  in  the  complementarity‐determining regions  of a  monoclonal antibody: A  study  of  the  modification‐structure‐function  correlations  by  hydrogen‐deuterium  exchange  mass  spectrometry. Anal. Chem. 2016, 88, 2041–2050.  43. Bonnington, L.; Lindner, I.; Gilles, U.; Kailich, T.; Reusch, D.; Bulau, P. Application of hydrogen/deuterium  exchange‐mass  spectrometry  to  biopharmaceutical  development  requirements:  Improved  sensitivity  to  detection of conformational changes. Anal. Chem. 2017, 89, 8233–8237.  44. Houde, D.; Arndt, J.; Domeier, W.; Berkowitz, S.; Engen, J.R. Characterization of igg1 conformation and  conformational dynamics by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 2009, 81, 5966.  45. Jensen,  P.F.;  Larraillet,  V.;  Schlothauer,  T.;  Kettenberger,  H.;  Hilger,  M.;  Rand,  K.D.  Investigating  the  interaction between the neonatal fc receptor and monoclonal antibody variants by hydrogen/deuterium  exchange mass spectrometry. Mol. Cell. Proteom. 2015, 14, 148–161.  46. More, A.S.; Toth, R.T.T.; Okbazghi, S.Z.; Middaugh, C.R.; Joshi, S.B.; Tolbert, T.J.; Volkin, D.B.; Weis, D.D.  Impact of glycosylation on the local backbone flexibility of well‐defined igg1‐fc glycoforms using hydrogen  exchange‐mass spectrometry. J. Pharm. Sci. 2018, 107, 2315–2324.  47. Zhang, A.; Fang, J.; Chou, R.Y.; Bondarenko, P.V.; Zhang, Z. Conformational difference in human igg2  disulfide isoforms revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Biochemistry 2015, 54,  1956–1962.  48. Iacob,  R.E.;  Bou‐Assaf,  G.M.;  Makowski,  L.;  Engen,  J.R.;  Berkowitz,  S.A.;  Houde,  D.  Investigating  monoclonal antibody aggregation using a combination of h/dx‐ms and other biophysical measurements. J.  Pharm. Sci. 2013, 102, 4315–4329.  49. Chalmers, M.J.; Busby, S.A.; Pascal, B.D.; He, Y.; Hendrickson, C.L.; Marshall, A.G.; Griffin, P.R. Probing  protein ligand interactions by automated hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem.  2006, 78, 1005–1014.  50. Ruiz,  F.M.;  Gilles,  U.;  Lindner,  I.;  Andre,  S.;  Romero,  A.;  Reusch,  D.;  Gabius,  H.J.  Combining  crystallography and hydrogen‐deuterium exchange to study galectin‐ligand complexes. Chemistry 2015, 21,  13558–13568.  51. Reusch, D.; Haberger, M.; Maier, B.; Maier, M.; Kloseck, R.; Zimmermann, B.; Hook, M.; Szabo, Z.; Tep, S.;  Wegstein,  J.;  et  al.  Comparison  of  methods  for  the  analysis  of  therapeutic  immunoglobulin  g  fc‐ glycosylation profiles—Part 1: Separation‐based methods. MAbs 2015, 7, 167–179.  52. Schmid, I.; Bonnington, L.; Gerl, M.; Bomans, K.; Thaller, A.L.; Wagner, K.; Schlothauer, T.; Falkenstein, R.;  Zimmermann, B.; Kopitz, J.; et al. Assessment of susceptible chemical modification sites of trastuzumab  and endogenous human immunoglobulins at physiological conditions. Commun. Biol. 2018, 1, 28.  53. Diepold, K.; Bomans, K.; Wiedmann, M.; Zimmermann, B.; Petzold, A.; Schlothauer, T.; Mueller, R.; Moritz,  B.; Stracke, J.O.; Molhoj, M.; et al. Simultaneous assessment of asp isomerization and asn deamidation in  recombinant antibodies by lc‐ms following incubation at elevated temperatures. PLoS ONE 2012, 7, e30295.  54. Thomann, M.; Malik, S.; Kuhne, F.; Avenal, C.; Plath, F.; Bonnington, L.; Reusch, D.; Bulau, P.; Cymer, F.  Effects of sialic acid linkage on antibody‐fragment crystallizable receptor binding and antibody dependent  cytotoxicity depend on levels of fucosylation/bisecting. Bioanalysis 2019, 11, 1437–1449.  55. Guttman, M.; Scian, M.; Lee, K.K. Tracking hydrogen/deuterium exchange at glycan sites in glycoproteins  by mass spectrometry. Anal. Chem. 2011, 83, 7492–7499.  56. Boyd, P.N.; Lines, A.C.; Patel, A.K. The effect of the removal of sialic acid, galactose and total carbohydrate  on the functional activity of campath‐1h. Mol. Immunol. 1995, 32, 1311–1318.  57. Mimura,  Y.;  Sondermann,  P.;  Ghirlando,  R.;  Lund,  J.;  Young,  S.P.;  Goodall,  M.;  Jefferis,  R.  Role  of  oligosaccharide residues of igg1‐fc in fc gamma riib binding. J. Biol. Chem. 2001, 276, 45539–45547.  58. Radaev, S.; Sun, P. Recognition of immunoglobulins by fcgamma receptors. Mol. Immunol. 2002, 38, 1073– 1083.  59. Kabat, E.A.; Wu, T.T.; Perry, H.; Gottesman, K.; Foeller, C. Sequences of Proteins of Immunological Interest;  NIH Publication: Bethesda, MD, USA; 1991.  Antibodies 2019, 8, 49  19  of  19  60. Hageman,  T.S.;  Weis,  D.D.  Reliable  identification  of  significant  differences  in  differential  hydrogen  exchange‐mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Anal. Chem. 2019,  91, 8008–8016.  61. Kiyoshi,  M.;  Tsumoto,  K.;  Ishii‐Watabe,  A.;  Caaveiro,  J.M.M.  Glycosylation  of  igg‐fc:  A  molecular  perspective. Int. Immunol. 2017, 29, 311–317.  62. Yu,  M.;  Brown,  D.;  Reed,  C.;  Chung,  S.;  Lutman,  J.;  Stefanich,  E.;  Wong,  A.;  Stephan,  J.P.;  Bayer,  R.  Production,  characterization,  and  pharmacokinetic  properties  of  antibodies  with  n‐linked  mannose‐5  glycans. MAbs 2012, 4, 475–487.    S.B.;  Middaugh, C.R.;  Volkin,  D.B.;  63. Okbazghi, S.Z.;  More,  A.S.;  White,  D.R.; Duan,  S.; Shah,  I.S.;  Joshi, Tolbert, T.J. Production, characterization, and biological evaluation of well‐defined igg1 fc glycoforms as a  model system for biosimilarity analysis. J. Pharm. Sci. 2016, 105, 559–574.  64. Kanda, Y.; Yamada, T.; Mori, K.; Okazaki, A.; Inoue, M.; Kitajima‐Miyama, K.; Kuni‐Kamochi, R.; Nakano,  R.; Yano, K.; Kakita, S.; et al. Comparison of biological activity among nonfucosylated therapeutic igg1  antibodies with three different n‐linked fc oligosaccharides: The high‐mannose, hybrid, and complex types.  Glycobiology 2007, 17, 104–118.  65. Goetze, A.M.; Liu, Y.D.; Zhang, Z.; Shah, B.; Lee, E.; Bondarenko, P.V.; Flynn, G.C. High‐mannose glycans  on the fc region of therapeutic igg antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology 2011, 21,  949–959.  66. Anthony, R.M.; Nimmerjahn, F.; Ashline, D.J.; Reinhold, V.N.; Paulson, J.C.; Ravetch, J.V. Recapitulation  of ivig anti‐inflammatory activity with a recombinant igg fc. Science 2008, 320, 373–376.  67. Shields, R.L.; Namenuk, A.K.; Hong, K.; Meng, Y.G.; Rae, J.; Briggs, J.; Xie, D.; Lai, J.; Stadlen, A.; Li, B.; et  al. High resolution mapping of the binding site on human igg1 for fc gamma ri, fc gamma rii, fc gamma  riii, and fcrn and design of igg1 variants with improved binding to the fc gamma r. J. Biol. Chem. 2001, 276,  6591–6604.  68. Powell,  L.D.;  Sgroi,  D.;  Sjoberg,  E.R.;  Stamenkovic,  I.;  Varki, A.  Natural  ligands  of the  b  cell  adhesion  molecule cd22 beta carry n‐linked oligosaccharides with alpha‐2,6‐linked sialic acids that are required for  recognition. J. Biol. Chem. 1993, 268, 7019–7027.  69. Falck, D.; Jansen, B.C.; Plomp, R.; Reusch, D.; Haberger, M.; Wuhrer, M. Glycoforms of immunoglobulin g  based biopharmaceuticals are differentially cleaved by trypsin due to the glycoform influence on higher‐ order structure. J. Proteome Res. 2015, 14, 4019–4028.  70. Barb,  A.W.;  Brady,  E.K.;  Prestegard,  J.H.  Branch‐specific  sialylation  of  igg‐fc  glycans  by  st6gal‐i.  Biochemistry 2009, 48, 9705–9707.  © 2019 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access  article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution  (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).  http://www.deepdyve.com/assets/images/DeepDyve-Logo-lg.png Antibodies Multidisciplinary Digital Publishing Institute

The Impact of Immunoglobulin G1 Fc Sialylation on Backbone Amide H/D Exchange

Download PDF
19 pages

Loading next page...
 
/lp/multidisciplinary-digital-publishing-institute/the-impact-of-immunoglobulin-g1-fc-sialylation-on-backbone-amide-h-d-veWbjT997G

References (75)

Publisher
Multidisciplinary Digital Publishing Institute
Copyright
© 1996-2019 MDPI (Basel, Switzerland) unless otherwise stated Terms and Conditions Privacy Policy
ISSN
2073-4468
DOI
10.3390/antib8040049
Publisher site
See Article on Publisher Site

Abstract

Article  The Impact of Immunoglobulin G1 Fc Sialylation on  Backbone Amide H/D Exchange  1,2 1 1 1 3 Felix Kuhne  , Lea Bonnington  , Sebastian Malik  , Marco Thomann  , Cecile Avenal  ,  3 1,3 1 2 1, Florian Cymer  , Harald Wegele  , Dietmar Reusch  , Michael Mormann   and Patrick Bulau  *    Pharma Technical Development, Roche Diagnostics GmbH, Nonnenwald 2, 82377 Penzberg, Germany;  felix.kuhne@roche.com (F.K.); lea.bonnington@roche.com (L.B.); sebastian.malik@roche.com (S.M.);  marco.thomann@roche.com (M.T.); harald.wegele@roche.com (H.W.); dietmar.reusch@roche.com (D.R.)    Institute of Hygiene, University of Muenster, Robert‐Koch‐Strasse 41, 48149 Muenster, Germany;  mmormann@uni‐muenster.de    Pharma Technical Development Analytics Biologics, F. Hoffmann‐La Roche Ltd., 4070 Basel, Switzerland;  cecile.avenal@roche.com (C.A.); florian.cymer@roche.com (F.C.)  *  Correspondence: patrick.bulau@roche.com; Tel.: +49‐8856‐60‐18039  Received: 30 August 2019; Accepted: 26 September 2019; Published: 1 October 2019  Abstract: The usefulness of higher‐order structural information provided by hydrogen/deuterium  exchange‐mass spectrometry (H/DX‐MS) for the structural impact analyses of chemical and post‐ translational  antibody  modifications  has  been  demonstrated  in  various  studies.  However,  the  structure–function assessment for protein drugs in biopharmaceutical research and development is  often  impeded  by  the  relatively  low‐abundance  (below  5%)  of  critical  quality  attributes  or  by  overlapping effects of modifications, such as glycosylation, with chemical amino acid modifications;  e.g., oxidation or deamidation. We present results demonstrating the applicability of the H/DX‐MS  technique to monitor conformational changes of specific Fc glycosylation variants produced by in  vitro  glyco‐engineering  technology.  A  trend  towards  less  H/DX  in  Fc  Cγ2  domain  segments  correlating with larger glycan structures could be confirmed. Furthermore, significant deuterium  uptake differences and corresponding binding properties to Fc receptors (as monitored by SPR)  between α‐2,3‐ and α‐2,6‐sialylated Fc glycosylation variants were verified at sensitive levels.  Keywords:  hydrogen/deuterium  exchange;  mass  spectrometry;  Fc  glycosylation;  antibody  conformation; higher‐order structure; biopharmaceutical; antibody effector function; FcγR binding;  structure‐function; sialic acid linkage  1. Introduction  Glyco‐engineering  of  the  antibody  fragment  crystallizable  (Fc)  has  improved  the  immune  effector function of direct‐targeting therapeutic antibodies (Ab) for almost a decade. The first glyco‐ engineered monoclonal antibody (mAb) was approved by the US Food and Drug Administration  (FDA)  in  2012.  Mogamulizumab  (Poteligeo ,  Kyowa  Hakko  Kirin  Co.,  Ltd.,  Tokyo,  Japan)  is  a  humanized anti‐CC motif chemokine receptor 4 (CCR4) immunoglobulin G1 (IgG1) derived from  Chinese  hamster  ovary  (CHO)  cells  [1].  It  was  followed  by  Roche’s  anti‐CD20  obinutuzumab  (Gazyva )  in  2013.  Both  drugs  are  predominantly  afucosylated;  i.e.,  the  level  of  N‐glycan  core  fucosylation (Fuc) is significantly reduced. An enhanced antibody‐dependent cellular cytotoxicity  (ADCC)  of  up  to  100‐fold  compared  to  its  fucosylated  counterpart,  was  the  rationale  for  this  Fc  engineering milestone [2]. This improved Fc effector function was proposed to be induced by closer  carbohydrate contacts between the antibody Fc and the FcγRIII immune receptor glycans [3].  The Fc carbohydrate moiety is covalently linked to N297 (EU numbering [4]) in the C’E‐loop of  the antibody heavy chain Cγ2 domain. Its core is built of a chitobiose; i.e., two N‐acetylglucosamines  Antibodies 2019, 8, 49; doi:10.3390/antib8040049  www.mdpi.com/journal/antibodies  Antibodies 2019, 8, 49  2  of  19  (GlcNAc), and three branched α‐mannosyl residues (Man), either α‐1,3 or α‐1,6‐linked to the core  Man. Predominantly, Fc N‐glycans are bi‐antennary and core‐fucosylated at the GlcNAc1 (Figure 1).  The antennae consist of various monosaccharides, such as Man, GlcNAc, galactose (Gal), and/or sialic  acid;  e.g.,  N‐acetylneuraminic  acid  (NANA).  The  main  Fc  glycan  variants  to  be  found  in  bio‐ therapeutic antibodies are G0F, G1F, and G2F; however, many minor variants, such as G0, G1, G2,  M5, hM3F, G2S1F, and G2S2F are also generated during the bioprocess. The diversity of N‐glycan  structures greatly contributes to the product heterogeneity. Thus, glycan levels are monitored during  manufacturing as a process consistency parameter. Furthermore, as described for mogamulizumab,  the Fc glycosylation can affect the product’s immune effector function, thus needs to be evaluated as  a critical quality attribute (CQA).  Figure 1. Study design. Trastuzumab drug substance (DS) was in vitro glyco‐engineered (IVGE) with  individual enzymatic post‐process treatment, as described in the methods section. The trastuzumab  Fc glyco‐variants obtained (as determined by 2‐AB HILIC; see Table 1 for details): G0F (81%), G2F  (83%), G2S2F ST3 (60%), and G2S2F ST6 (43%). An additional trastuzumab Man5 variant (88%) was  prepared  by  kifunensine  treatment  during  the  fermentation  processing.  All  glyco‐variants  were  protein A purified after IVGE treatment and further structurally and functionally characterized with  2‐AB  HILIC,  SEC,  LC‐MS/MS  (quality  attributes),  HDX‐MS  (higher‐order  structure),  and  SPR  (functional testing).  Interestingly, upon receptor binding of Abs, the Fc carbohydrate moiety does not interact with  the FcγR protein structure directly [5–7]. As a consequence, the concept of fine‐tuning the immune  system’s  effector  function  by  regulating  the  Fc‐glycosylation  has  been  discussed  [8–10];  i.e.,  Fc  binding  is  naturally  modulated  through  interactions  of  the  specific  Fc  N‐glycan  structures  with  themselves and with  the  antibody protein structure.  Many of those interactions  are suspected to  stabilize the conformation of the receptor‐interacting Cγ2 domain. The Cγ2 C’E‐loop’s flexibility has  been  described  to  increase  with  shorter  carbohydrate  structures  [11–13],  which  in  turn  leads  to  decreased Fc binding activities [9,11,14]. Moreover, the stepwise enzymatic, as well as in silico glycan  truncation, revealed a twisting motion of the two Cγ2 domains relative to each other and a decrease  in distance between them with shorter glycans [11,12,15–17]. Taken together, the Fc‐glycosylation is  proposed to modulate and pre‐organize the receptor binding interface for optimal effector function  [13].  Antibodies 2019, 8, 49  3  of  19  Upon complete removal of the Fc N‐glycan, binding to the clinically relevant immune receptors  (i.e., FcγRI, FcγRIIa/b, and FcγRIIIa/b present on various leucocytes) is considerably reduced or even  completely eliminated [18,19]. Accordingly, de‐glycosylation has been shown to have a major impact  on the structural integrity of the Cγ2 domain [17]. With attached sugars, non‐covalent interactions  with the protein surface, mainly hydrophobic residues, increase [11]. Such site‐specific interactions  with  the  antibody  framework  have  been  described  for  the α‐1,6‐arm  GlcNAc  and  Gal  residues  [11,20,21]. GlcNAc has been observed to interact with F243, K246, and T260 [11,21]. Accordingly,  mutations of F241 and F243 led to reduced FcγRIII binding of hyper‐galactosylated IgG‐Fc molecules  [9,10]. For di‐galactosylated IgGs as well, the backbone amides of L243, F244, and K247 (according to  EU numbering [4]: L242, F243, and K246) have been interpreted as less solvent accessible due to the  interactions’ involvement [17,21]. In close agreement, doubly galactosylated Cγ2 domains have been  found  to  be  arranged  at  a  maximal  distance  to  each  other,  which  may  be  a  favored  interface  conformation  for  FcγRIII  interaction  [11].  In  any  case,  although  less  effective  than  afucosylation,  hyper‐galactosylation increases the mAb effector function [22,23]. Indeed, patients with rheumatoid  arthritis have been reported to exhibit more IgGs with G1F and G2F compared to healthy patients  [24].  Sialylation of the N‐glycan termini has been demonstrated to regulate the immune modulatory  feature (towards anti‐inflammatory properties) of so‐called intravenous immunoglobulins (IVIGs), a  mixed fraction of healthy donor IgGs for the treatment of immunoglobulin deficiency and various  immune‐mediated diseases; e.g., chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP) [25– 28]. Approximately 10%–11% of human IVIGs are sialylated and 1%–4% are di‐sialylated [26,27,29].  The  switch  from  pro  to  anti‐inflammatory  behavior  has  been  ascribed  again  to  conformational  changes in the Cγ2 domains and has been supported by functional and structural data [30,31]. Several  studies  observed  reduced  binding  affinities  of  sialylated  IgGs  for  FcγRs  and  their  consequent  reduction in cytotoxicity [26,31,32], whereas other reports did not demonstrate functional changes  upon  terminal  sialylation  [23,33,34].  Independent  from  Fc  function,  an  increase  in  inter‐domain  flexibility, including the reorientation of residue F241, and a slightly extended motion of the glycan  have  been  described  [6,30].  In  a  more  recent  in  silico  study,  Harbison  et  al.  demonstrated α‐2,6‐ linkages to show a higher conformational freedom, which allows for the increased motion of terminal  sialic acids α‐2,6‐linked to galactoses [35].  Many  biophysical  methods  fail  to  detect  such  minor  conformational  changes  of  large  bio‐ molecules, as they provide a global view on protein structure. The traditional analytical methods for  monitoring  higher‐order  structures  (HOS),  such  as  circular  dichroism  (CD),  Fourier‐transform  infrared spectroscopy (FTIR), UV, and fluorescence spectroscopy, are insufficiently sensitive to detect  minor  spatial  changes  in  large  proteins  such  as  antibodies,  and  rather,  deliver  information  only  pertaining to the entire averaged molecule. Changes induced in the HOS through chemical or post‐ translational  modifications  (PTM)  may  be  limited  to  specific  local  regions  in  the  protein,  which,  despite not affecting the overall structure, may still influence the bioactivity or pharmacokinetic (PK)  behavior of a bio‐therapeutic drug. Methods with an adequate structural resolution capability, e.g.,  X‐ray  crystallography,  fail  to  provide  dynamic  information  and are  quite  time‐consuming.  NMR  facilitates the investigation of molecular dynamics, but is restricted in terms of molecule size and  sample  concentration  [15].  The  potential  of  hydrogen/deuterium  exchange‐mass  spectrometry  (H/DX‐MS) as an alternative method to these traditional approaches has been demonstrated widely  in the literature [36]. Hydrogen/deuterium exchange (H/DX) monitors protein backbone dynamics,  as  amide‐bound  hydrogens  exchange  according  to  hydrogen  bond  formation  and/or  solvent  accessibility. HDX‐MS, therefore, screens static and dynamic molecular alterations that influence the  protein backbone.  Meanwhile, the application of H/DX‐MS in the biopharmaceutical industry has become well‐ established. Many examples of H/DX‐MS applied to structural changes in biopharmaceutical proteins  [37,38], including mAbs [17,39–42] exposed to extreme stress conditions, have been published. The  impact of chemical modifications and PTMs on the backbone amide hydrogen exchange behavior  have been studied intensively [17,21,40,43]; e.g., for methionine oxidation [17,40,43], de‐glycosylation  Antibodies 2019, 8, 49  4  of  19  [44,45],  de‐/hyper‐galactosylation  [17],  high  mannose  variants  [21,46],  and  afucosylation  [17].  Likewise, the applications of H/DX‐MS to characterizing mAb disulfide isoforms [47] and aggregates  [48] have also been reported. The utilization of H/DX‐MS for epitope mapping and ligand binding  investigations of therapeutic proteins is especially well‐established [49,50]. Recently, an improved  H/DX‐MS workflow for the detection of down to 1% Fc oxidation (M252) was published [43]. With  the developed approach described, we now demonstrate the applicability of the H/DX‐MS technique  to monitor relevant structural changes using enzymatically altered Fc glycosylations, created by the  previously introduced, in vitro glyco‐engineering (IVGE) technology [23]. As a model system for the  specific  CQA  assessment  of  bio‐therapeutic  proteins,  the  conformational  impact  of  defined  Fc  glycosylations on antibody effector function was systematically examined in this study. Trastuzumab  (Herceptin )  was  chosen  as  an  appropriate  model  for  the  investigation,  due  to  the  existence  of  extensive analytical and characterization data, in‐house and in the literature.  2. Materials and Methods  2.1. Enzymatic Preparation of Fc Glycan Variants  Trastuzumab  was  expressed  from  Chinese  hamster  ovary  (CHO)  cells  and  formulated  at 25  mg/mL  in  60  mM  histidine‐HCl  buffer,  pH  6.0.  Bioprocessing  was  conducted  for  Herceptin   manufacturing. Post‐process enzymatic treatment of trastuzumab (starting material) was performed  as  follows.  The  hypo‐galactosylated  “G0F”  variant  was  generated  by  addition  of  1.5  mL β‐1,4‐ galactosidase  (200  mU,  ProZyme  Inc.,  Hayward,  CA,  USA)  to  190  mg  starting  material  and  subsequent incubation at 37 °C for 24 h. For the hyper‐galactosylated “G2F” variant, 1.4 g starting  material was mixed with 220 mL reaction buffer (10 mM UDP‐Gal, 5 mM MnCl2, 100 mM MES, pH  6.5) and 42 mg β‐1,4‐galactosyltransferase (5.5 ± 0.5 mg/mL, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,  Germany), and incubated at 32 °C for 28 h. Further, 205 mg CMP‐NANA (c = 4 mg/mL in H2O) and  41 mg α‐2,3‐sialyltransferase or α‐2,6‐sialyltransferase (5.5 ± 0.5 mg/mL, Roche Diagnostics GmbH)  were added to 410 mg of the G2F variant to obtain the “ST3” or the “ST6” variant, respectively. The  samples  were  then  diluted  with  200  nM  alkaline  phosphatase  (AP)  and  0.1  mM  ZnCl2  (final  concentrations), and subsequently incubated at 37 °C for 24 h. For the ST6 variant, another 41 mg α‐ 2,6‐sialyltransferase and 200 mg CMP‐NANA (c = 10 mg/mL in H2O), as well as AP and ZnCl2 (final  concentrations: 264 nM and 0.1 mM) were added. The ST6 sample was then again incubated at 37 °C  for 17 h. To obtain the trastuzumab “Man5” high mannose variant, 0.1 μg/mL kifunensine was added  during cell cultivation (titer: 0.58 mg/mL trastuzumab). Purified material (mainly M5–M9 variants)  was buffer‐exchanged with 0.1 M sodium acetate, 0.5 mM CaCl2 (pH 5.0) and enzymatically glyco‐ engineered by the addition of 26 μg α‐1,2‐mannosidase (Genentech Inc., South San Francisco, CA,  USA) per mg mAb (to obtain predominantly M5 variants). The reaction was performed at 37 °C for  24 h. The de‐glycosylated variant (hereinafter denoted as “Degly”) was obtained by treatment of 380  mg starting material with 1.9 mL PNGaseF (250 U, Roche Diagnostics GmbH), further formulated  with 10 mM sodium phosphate, pH 7.2, and incubated at 37 °C for 24 h. The starting material was  also utilized as reference material “RM” throughout all experiments. Therefore, trastuzumab was  incubated in drug substance (DS) sample buffer at 37 °C for 24 h and otherwise treated analogously.  All  samples  were  finally  purified  by  Protein  A  chromatography  and  buffer‐exchanged  with  DS  sample buffer.  2.2. Analysis of Trastuzumab Quality Attributes  For  the  quantification  of  individual  glycan  species,  200 μg  trastuzumab  sample  was  buffer‐ exchanged  with  10  mM  ammonium  formate  buffer  (pH  8.6)  and  incubated  with  2 μL  PNGaseF  (500,000 units/mL, New England Biolabs GmbH, Frankfurt, Germany) at 45 °C for 1 h. Glycan 2‐ aminobenzamide (2‐AB) labeling was performed at 65 °C for 2 h (Signal™ 2‐AB labeling kit, ProZyme  Inc.). Labeled glycans were hydrophilic interaction chromatography (HILIC)‐separated (Waters, BEH  Glycan 1.7 μm, 2.1 × 150 mm) and fluorescence‐detected on a Waters ACQUITY UPLC system, as  recently described [51].  Antibodies 2019, 8, 49  5  of  19  Liquid  chromatography‐mass  spectrometry  (LC‐MS/MS)  peptide  mapping  and  the  quantification  of  relevant  amino  acid  modifications  were  principally  conducted  as  previously  described [52,53]. In brief, all samples were denatured with 8 M Gua‐HCl (pH 6.0) and reduced with  10 μL (c = 0.1 g/mL) dithiothreitol (DTT) at 50 °C for 1 h. Samples were buffer‐exchanged (0.02 M His‐ HCl, pH 6.0) and further digested with 10 μL (c = 0.25 mg/mL) trypsin (Roche Diagnostics GmbH) at  37  °C  for  18  h.  Peptide  separation  (BEH  C18  1.7 μm,  2.1  ×  150  mm)  was  performed  on  a  Waters  ACQUITY UPLC system. Online mass spectrometric detection was generated with a Waters Synapt  G2 HDMS Q‐ToF mass spectrometer. For relative quantification of modified peptides, GRAMS AI  (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA) was used.  Size exclusion chromatography (SEC) was performed with 20 μg protein sample on a Waters  Alliance HPLC instrument with a BioSuite™ column (250 Å, 5 μm, 7.8 × 300 mm). With mobile phases  of 200 mM KH2PO4 and 250 mM KCl (pH 7.0), and at a flow rate of 0.5 mL/min, variants were UV280  detected and peak‐integrated for the quantification of molecular weight species.  2.3. FcγR Binding Study  An in‐house study on the Fc binding characteristics, as evaluated by surface plasmon resonance  (SPR) analysis, has been recently published in the journal Bioanalysis (Future Science Ltd., London,  UK) [54]. It covers the data sets discussed in this manuscript, but with a focus on functionality. The  data was re‐assessed for direct comparison to the starting material for the experiments herein. The  interactions between the trastuzumab glycan variants and immobilized immune receptors generated  (FcγRIa, FcγRIIa H131, FcγRIIa R131, FcγRIIb/c, FcγRIIIa F158, and FcγRIIIa V158) were measured  with a Biacore T200  instrument (GE Healthcare Inc.); procedure described in detail by Thomann et  al. [54].  2.4. Higher‐Order Structure (HOS) Characterization by Hydrogen/Deuterium Exchange‐Mass Spectrometry  (H/DX‐MS)  For structural characterization, the trastuzumab variants were adjusted to 6.6 mg/mL in 10 mM  KH2PO4/K2HPO4 buffer, pH 7.0. H/DX was achieved by 1:20 dilution in 10 mM K2HPO4/KH2PO4/D2O  buffer, pH 7.0, at room temperature. The exchange reaction was quenched by 1:2 dilution with ice‐ cold  100  mM  K2HPO4/KH2PO4,  500  mM  TCEP,  and  4  M  guanidine,  pH  2.4.  The  samples  were  immediately shock frozen on dry ice and stored at −80 °C.  For the targeted H/DX approach, exchange reactions were quenched after 10 min of H/DX. Three  varying combinations, with n = 6 replicates per (glyco‐)variant, were prepared with significant time  intervals  in  between.  Non‐deuterated  reference  samples  of  all  glycan  variants  were  prepared  in  triplicate. For the time course H/DX approach, reactions were quenched after 0.5 min, 1 min, 10 min,  30 min, 1 h, 3 h, and 48 h. Deuterated and non‐deuterated samples were prepared in triplicate.  All samples (of both H/DX approaches) were measured on a Waters nanoAcquity UPLC M‐Class  system with H/DX technology connected to a Waters Synapt G2 HDMS Q‐ToF mass spectrometer.  Each  sample  was  thawed  immediately  prior  to  measurement.  Sample  injection  (55  pmol)  was  performed manually. The coupled 2D‐LC setup operates with online‐digestion at 15 °C; subsequent  trapping was at 0 °C on a Waters Acquity UPLC BEH C18 Van guard pre‐column (1.7 μm, 2.1 × 5.0  mm); and final separation was on a Waters BEH C18 analytical column (1.7 μm, 1 × 100 mm). For  online‐digestion, either an immobilized pepsin/type XIII (NovaBioAssays LLC, Woburn, MA, USA)  or Poroszyme™ pepsin column (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) was used. Back‐ exchange  (i.e.,  deuterium  loss)  was  determined  as  49%  ±  14%  using  the  48  h  labeling  values  as  approximation for 100% exchange. The percentage difference of theoretical and measured deuterium  uptake per peptide, was averaged for the whole IgG sequence. The H/DX data was not corrected for  this deuterium loss, as only the relative levels of deuterium incorporation between the samples have  been compared.  Peptide identification was performed with Waters ProteinLynx Global Server™ 3.0.2. The data  was processed and analyzed with Waters DynamX 3.0.0. Detected charge states were averaged for  the individual peptides. The relative deuterium uptake (average D uptake) per peptide [Da] was  Antibodies 2019, 8, 49  6  of  19  calculated compared  to that of the non‐deuterated samples. Uptake differences between samples  were calculated by subtraction of the corresponding average uptake values. The reduction in H/DX  was calculated by normalization on de‐glycosylated trastuzumab (showing maximum exchange in  affected protein regions and used as a system suitability test for every H/DX‐MS experiment).  3. Results  The  Fc  glycan  variants  were  generated  by  applying  post‐process  enzymatic  engineering  to  trastuzumab  starting  material  (Figure  1).  As  described  recently,  this  IVGE  approach  was  accomplished by the systematic and differential use of commercially available recombinant enzymes  [23]. The Fc glycan distribution was monitored by 2‐AB labeling of the liberated oligosaccharides.  The results are summarized in Table 1.  In detail, a hypo‐galactosylated variant “G0F” (81% G0F), a hyper‐galactosylated variant “G2F”  (83% G2F), and two differentially sialylated variants “ST3” (60% G2S2F) and “ST6” (43% G2S2F) with  α‐2,3‐ or α‐2,6‐linked sialic acids were produced. A variant with significant, high mannose levels  “Man5” (88% Man5) was also generated through the application of the cytotoxin kifunensine during  the  fermentation  processing,  followed  by α‐1,2‐mannosidase  treatment.  In  addition,  a  de‐ glycosylated sample “Degly” was prepared by PNGaseF treatment. Equally treated, but unprocessed  trastuzumab reference material was utilized as a control sample “RM.”  To  assess  structurally  relevant  chemical  and  post‐translational  amino  acid  modifications,  potentially induced by the IVGE sample processing, all samples generated were further evaluated by  LC‐MS/MS peptide mapping (Table 2). The difference in light chain N30 deamidation was quantified  at  a  maximum  variation  of  2.2%  relative  abundance.  The  heavy  chain  D98  isomerization  was  determined  within  3.0%  variance.  The  corresponding  succinimide  formation  was  found  to  vary  within 1.8% relative abundance. More importantly, the oxidation level for the susceptible residue  M252 in the conserved IgG1 region was determined to be equally and only moderately elevated up  to a maximum of 2.6%, for all IVGE samples compared to the trastuzumab reference material. In  summary, no significant alterations for chemical and post‐translational modifications were observed  for the IVGE samples. In addition, the potential formation of antibody fragments and aggregates was  investigated  by  size  exclusion  chromatography  (SEC).  Likewise,  no  alterations  in  distribution  of  molecular weight species compared to the trastuzumab reference material could be detected (Table  3).  The  Fc  glycan  variants  were  further  analyzed  by  a  systematic  structural  and  functional  characterization approach. An optimized targeted H/DX‐MS approach for the detectability of minor  structural changes within a set time range was established, as recently described [43]. An optimal  deuterium  (D)  incubation  time  of  10  min  was  determined  (data  not  shown).  The  2D  LC‐MS/MS  peptide  mapping  (online  pepsin/type  XIII  protease  digestion  and  subsequent  RP  C18  separation)  yielded sequence coverages of 87%–94% and 81%–98% for the non‐deuterated antibody heavy and  light chains, respectively. For each glycan variant over all three data sets was collected, and generated  by two independent operators and with two different digestion columns, corresponding to up to 18  replicates for each sample (Figures 2 and 3).  The visualization of glycan‐induced structural changes was realized by calculation of the relative  deuterium uptake (D uptake) difference in [Da] for the RM sample (Figure 2). This representation is  used here to facilitate identification of trends elicited by the various individual N‐glycans compared  to a “standard” heterogeneous mixture (RM). Most of the changes were seen for the heavy chain Cγ2  domain, but minor changes were for the heavy chain Cγ3 domain, and none were for the light chain  (Figure 2 and Figure S1). The sialylated variants ST3 and ST6, as well as the Degly variant, all showed  less H/DX within the Cγ3 domain region V369‐E380 compared to the RM (Figure 2). The Cγ2 domain  uptake differences were observed for the peptides with amino acids (aa) 235‐240, aa235–241, aa241– 252, aa242‐251, aa242–252, aa243‐252, aa244‐252, aa262‐277, and aa263‐277 (for EU numbering [4] for  shared peptic/type XIII peptides of three targeted experiments, see Table S1). Affected areas are the  A‐strand, the following AB‐helix, the B‐strand, the BC‐loop and the C‐strand of the Cγ2 domain  (Figure 2c–h, structure based on PDB ID code: 5VGP). Three distinct regions with significant uptake  Antibodies 2019, 8, 49  7  of  19  differences  can  be  described:  L235–F241  (hinge/A‐strand),  F241–M252  (A‐strand/AB‐helix),  and  V262–W277 (B‐strand/BC‐loop/C‐strand), graphically illustrated in Figure 3a. No differences could  be detected for the region I253–V262, which contains the intra‐domain disulfide bond between C261  and  C321  [12].  Further,  the  glyco‐peptide  uptake  differences  were  not  determined  between  the  different variants due to the diversity of glycan structures. The varying number of H/D exchanging  acetamido groups on the individual glycans makes it impossible to quantitatively compare peptides  within the C’E‐loop area, i.e., the glycosylation site, as has been described in detail by Guttman et al.  and More et al. [46,55].  Table 1. Relative quantification of 2‐AB labeled (trastuzumab) N‐glycans (2‐AB HILIC).  Fc Glycosylation (%)  Trastuzumab    RM  Man5  G0F  G2F  G2S2F ST3  G2S2F ST6  G0  3.5  3.6  0.5  5.2  0.1  n.q.  0.4  G0F  34.2  39.3  3.4  80.6  n.q.  0.0  0.2  G1  2.8  2.9  1.0  0.1  0.1  0.2  0.7  G1F  41.9  39.0  3.3  1.4  0.4  0.1  0.1  G2  0.4  0.3  0.1  n.q.  5.4  0.5  0.4  G2F  9.3  7.2  0.8  0.7  83.1  1.6  1.8  G2S1  0.1  0.1  n.q.  0.2  n.q.  1.7  3.4  G2S1F  0.9  0.6  0.2  0.2  1.7  13.8  26.5  G2S2  0.1  n.q.  n.q.  n.q.  0.5  3.9  2.8  G2S2F  0.2  0.3  n.q.  0.1  n.q.  60.3  42.9  M3  n.q.  n.q.  0.1  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  M3F  n.q.  n.q.  0.1  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  hM3  0.4  0.6  0.2  1.0  0.0  0.1  0.3  hM3F  0.6  1.2  0.3  2.2  0.0  n.q.  0.2  hM3G1S1  0.1  0.1  n.q.  0.1  0.1  1.9  2.5  hM3G1S1F  0.3  0.4  n.q.  0.6  0.5  4.4  3.7  M4  n.q.  n.q.  0.1  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  hM4  0.3  0.3  n.q.  n.q.  1.0  0.1  1.2  hM4F  0.0  n.q.  n.q.  0.0  2.2  n.q.  n.q.  M5  1.3  1.3  88.3  1.4  1.4  3.1  3.3  hM5  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  M6  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  M7  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  n.q.  not assigned  3.9  2.8  1.4  6.3  3.5  8.3  9.7   Method reference standard; n.q. = not quantifiable.  In absence of glycan structures, the Cγ2 domain has been repeatedly shown to be susceptible to  H/DX [17,44–46]. Accordingly, Degly incorporated considerably more deuterium than RM (up to Δ‐ 0.9  Da  per  peptide  within  the  Cγ2  regions  L235–M252  and  V262–W277,  see  Table  S1).  The  corresponding uptake differences per peptide were negative, as shown for the RM (Figure 2a–c). As  demonstrated  in  literature  before  [17,19,56–58],  the  Fc  binding  activity  was  found  to  be  almost  completely lost in the absence of the Fc glycan (Figure 4 and Table S2). Only a weak relative binding  activity for the FcγRIa receptor remained (Figure 4a). With an uptake difference of Δ−0.4 Da (L235– M252  and  V262–W277),  the  RM  also  incorporated  less  deuterium  than  the  Man5  sample  (Figure  2a,b,d and Table S1). In contrast, hyper‐galactosylation (G2F) and α‐2,6‐sialylation (ST6) stabilized  and/or shielded the A‐strand and the AB‐helix; i.e., incorporated even less deuterium than the RM  (Figure 2a,b,f,h). In the region F241–M252, the RM exhibited an average uptake difference of Δ0.5 Da,  compared to the G2F variant, and Δ0.6 Da compared to the ST6 sample (Table S1). Interestingly, the  Cγ2 region F241–M252 of the ST3 variant did not reveal uptake differences relative to the RM (Figure  2a,b,g). Uptake differences of Δ‐0.3 and Δ‐0.4 Da were calculated for the other two regions L235–F241  and V262–W277, respectively. Further, the trastuzumab RM exhibited an uptake difference of Δ‐0.3  Da within the A‐strand/AB‐helix (aa241–252) compared with the G0F variant.  Antibodies 2019, 8, 49  8  of  19  Table 2. Relative quantification of chemical amino acid modifications (LC‐MS peptide mapping).  Chemical Mod. (%)  Trastuzumab    RM  Degly  Man5  G0F  G2F  G2S2F ST3  G2S2F ST6  LC N30   deamidation  9.6  8.7  10.9  9.1  9.1  9.0  9.6  10.0  LC N30   succinimide  0.6  0.7  0.7  0.6  0.8  0.7  1.1  1.1  HC N54   deamidation  1.5  1.6  1.7  2.2  1.7  2.0  1.8  1.6  HC N54   succinimide  3.9  4.0  3.9  4.1  3.9  3.9  3.7  3.8  HC D98   isomerization  7.7  7.6  8.0  10.0  7.0  7.7  7.9  8.7  HC D98   succinimide  3.5  4.1  3.6  2.5  4.3  3.8  4.3  4.3  HC N389/390   deam.  2.0  1.9  2.2  1.6  1.9  1.9  2.1  2.0  HC N389/390   succ.  1.7  1.7  1.7  2.0  1.8  1.7  1.8  1.8  HC M252   oxidation  2.3  2.6  3.4  5.2  3.0  3.8  3.8  3.8  1 2 3  Method reference standard;   Kabat numbering [59];   EU numbering [4].  Table 3. Relative quantification of trastuzumab size variants (SEC‐UV).  Mol. Weight Species (%)  Trastuzumab    RM  Degly  Man5  G0F  G2F  G2S2F ST3  G2S2F ST6  Monomer  99.8  99.6  99.6  99.4  99.6  99.3  99.2  99.1  total HMW    0.2  0.4  0.4  0.5  0.3  0.7  0.8  0.9  total LMW    0.0  0.0  0.1  0.1  0.1  0.0  0.0  0.1  1 2 3  Method reference standard;   high molecular weight species;   low molecular weight species.  The  data  are  presented  in  Figure  3a–d  alternatively,  normalized  with  the  de‐glycosylated  trastuzumab  sample.  The  reduction  in  H/DX  was  calculated,  as  correlated  with  the  successive  structural extension of the Fc glycan. Several peptides for the three distinct regions are shown. For  the RM, the H/DX of the representative peptide aa235–241 was reduced by 38% ± 2% (Figure 3a and  Table S1). The representative peptides aa241–252 and aa262–277 showed 26% ± 2% and 20% ± 1%  reductions, respectively. With an 18% ± 4% reduction in H/DX, the hypo‐galactosylated G0F variant  was  found  to  exhibit  slightly  lower  values  for  the  aa241–252  peptide  (Figure  3a  and  Table  S1).  Accordingly,  the  G0F  sample  revealed  a  similar  relative  binding  activity  for  FcγRI‐III  receptors  compared to the RM (Figure 4b–f). For the Man5 sample, a significantly lower H/DX reduction of  13% ± 1% for the aa241–252 peptide was observed. An equivalent offset could be observed for the  Man5 Cγ2 BC‐loop area V262–W277, with an 11% ± 1% (versus 20% ± 1% for the RM) reduction in  H/DX, and an even more significant shift for the hinge/A‐strand segment, including residues L235– F241 with a 19% ± 1% (versus 38% ± 2% for the RM) reduction in H/DX (Figure 3b).  As stated earlier,  the hyper‐galactosylated G2F variant was  found to be less prone  to H/DX  within its Cγ2 domain (41% ± 1% versus 26 ± 2% (RM) reduction in H/DX for aa241–252). This is in  contrast to the hypo‐galactosylated G0F and high mannose Man5 variants. The presence of galactoses  appears to reduce the exchange of amide‐bound hydrogens within the Cγ2 A‐strand/AB‐helix region  (Figure 3a,c). The sialylated ST6 variant exhibits even further diminished Cγ2 dynamics/accessibility  (49% ± 3% reduction in H/DX for the aa241–252 peptide; Figure 3a,d). Correspondingly, the G2F and  ST6 variants also revealed different relative binding activities for FcγR receptors (Figure 4). In detail,  the binding affinity to the FcγRIIIa (V158 and F158) was found to be enhanced for the G2F variant  (120% ± 1% and 124% ± 1%; see Table S2). In addition, the ST6 variant showed increased binding  activity for the FcγRIIa R131 (130% ± 2%), FcγRIIa H131 (120% ± 1%), FcγRIIb/c (162% ± 4%), FcγRIIIa  V158 (121% ± 1%), and the FcγRIIIa F158 (150% ± 1%) compared to the trastuzumab starting material  (Table S2, Figure 4b–f).  Antibodies 2019, 8, 49  9  of  19  Figure 2. Average deuterium (D) uptake differences (Da) of trastuzumab reference material (RM) and  glyco‐engineered trastuzumab variants (n = 6) after 10 min of H/DX. (a) Differential heat map and (b)  uptake plot of (shared) trastuzumab heavy chain peptides, resulting from pepsin/type XIII digestion  (sequence coverage 87%–94%). (c–h) Differential D, uptake as established in (a) and projected onto Fc  crystal structures based on PDB ID code 5VGP: (c) “Degly”, (d) “Man5”, (e) “G0F”, (f) “G2F”, (g)  “ST3”, and (h) “ST6”.  Interestingly, the α‐2,3‐linked G2S2F variant (ST3) revealed an opposite trend for H/DX and  FcγR receptor binding activity compared to the ST6 variant. The regions L235–F241 and V262–W277  showed 27% ± 2% (versus 38 ± 2% for the RM) and 11% ± 1% (versus 20 ± 1% for the RM) reductions  in H/DX. With a 27% ± 3% reduction in H/DX, the area including the A‐strand and flanking the AB‐ Antibodies 2019, 8, 49  10  of  19  helix  (F241–M252)  exhibited  a  similar  exchange  behavior  as  observed  for  the  RM  (Figure  3a).  Accordingly, the  ST3 sample revealed reduced binding affinity (up to around 40%)  to the  tested  FcγIIa/b/c  and  FcγRIIIa  receptors  (Figure  4b–f),  but  had  no  significant  effect  on  FcγRIa  binding  (Figure 4a). Most severely, the FcγRIIIa F158 interaction was found to be impaired, with 62% ± 1%  relative binding (Figure 4e).  We further analyzed the observed differences in H/DX and corresponding binding affinities for  Fcγ  receptors  between  the  ST3  and  ST6  variants  by  an  expanded  H/DX  approach  (time  course  experiment).  The  differences  in  H/DX  between  the α‐2,3  and  the α‐2,6‐sialylated  trastuzumab  variants  observed  at  10  min  deuterium  incubation  time  (Figure  3d)  could  be  verified  for  the  additional time points investigated (0.5 min, 1 min, 10 min, 30 min, 1 h, 3 h, and 48 h), as shown in  Figure  5.  Sequence  coverages  of  88%  for  both  the  heavy  and  the  light  chains  were  achieved.  As  illustrated in Figure 5, the two G2S2F variants revealed significant uptake differences for the heavy  chain Cγ2 domain regions L235–M252, V262–W277, and Y278‐N325 (no changes were seen for the  light chain as shown in Figure S2). The respective values and peptic/type XIII peptides are listed in  the Supplementary Table S3. The three regions of varying D uptake also revealed differences in the  exchange rates (Figure 5a). The corresponding relative D uptake curves are depicted in Figure 5b–u.  For the residues L235–M252, the maximum D uptake difference between the two sialic acid variants  was already reached after 10 min (Figure 5c–j). With an uptake difference of Δ0.3 Da for the aa235– 241 and Δ0.6 Da for the aa242–252 peptides, the ST3 variant exchanged more hydrogen than the α‐ 2,6‐linked ST6 variant in this region (Figure 5d,g and Table S3). Notably, only the peptide aa235–241  exhibited further H/D exchange beyond 60 min in this region (Figure 5d). The area V262–W277 (e.g.,  aa263–275) followed an overall faster exchange rate, but the uptake difference maximum appeared  later  (after  60  min  with  maximum Δ0.7  Da  uptake  difference;  see  Figure  5l  and  Table  S3).  This  explains the overall lower H/DX differences observed in the preceding 10 min targeted approach for  that sequence area (V262–W277), as shown in Figure 3a. The uptake difference maximum for the  glycosylated region Y278–N325 (C‐strand to FG‐loop) was reached even more rapidly (Figure 5a).  Comparison  of  the  doubly  sialylated glyco‐peptide  revealed more  D  uptake  within  the  C’E‐loop  (E294‐R301) for several ST3 variant peptides within the region (Figure 5o–t). In detail, maximum  uptake differences compared to the ST6 variant were observed already after 1 min; e.g., with Δ2.6 Da  for the  peptide aa278–305 (Figure 5p).  We further found  that amino acid regions adjacent to  the  glycosylation site showed slow H/D exchange rates at incubation times <60 min. As visible for the  heavy chain peptide aa301–306 (Figure 5u), a significant exchange difference can only be detected  after 3 h (Δ0.2 Da) and 48 h (Δ0.5 Da). Together, this indicates that the α‐2,3‐linkage impacts the  glycan  dynamics  more  significantly,  resulting  in  an  increased  motion  of  the  Cγ2  C’E‐loop  area  compared to the α‐2,6‐linkage.  Overall, the time course data identifies the 10 min deuterium incubation time, selected for the  targeted H/DX experiments, as suitable for the detection of H/DX differences caused by different N‐ glycosylations. Moreover, the structural observations for ST3 versus ST6 are in close agreement with  the differential binding activities for FcγR receptors, as probed by SPR (Figure 4).  Antibodies 2019, 8, 49  11  of  19  Figure 3. Reduction in H/DX (%) of trastuzumab glycan variant Cγ2 domain peptides, resulting from  pepsin  or  pepsin/type  XIII  digestion  (sequence  coverage  87%–94%),  normalized  with  the  de‐ glycosylated  trastuzumab  sample.  (a)  Single  peptide  values  of  three  targeted  (10  min  H/DX)  experiments with trastuzumab Man5 (light blue), G0F (green), RM (black), ST3 (red), G2F (gray), and  ST6 (orange). (b–d) Box plots with single peptide values of single experiments (n = 6) and representing  boxes showing minimum, 25th percentile, median, 75th percentile, and maximum values. Additional  statistical significance testing was as recently described by Hagemann et al.; see Figure S3 [60].  1  Figure  4.  (a–f)  Relative  FcγR  binding  (%)  of  trastuzumab  (glyco‐)variants,  as  normalized  with  trastuzumab starting material. Binding affinities were measured by surface plasmon resonance (SPR)  technology; n = 3.  Antibodies 2019, 8, 49  12  of  19  Figure 5. D uptake (Da) of differentially sialylated trastuzumab glycan variants (n = 3). Shown are  heavy chain peptides, as obtained by pepsin/type XIII digestion (sequence coverage 88%). (a) Uptake  difference plot of H/DX time course experiment performed for 0.5 min (pink), 1 min (light blue), 10  min (orange), 30 min (green), 1 h (red), 3 h (purple), and 48 h (black). (b–u) Relative uptake curves of  individual peptides, as summarized in (a).  Antibodies 2019, 8, 49  13  of  19  4. Discussion  Many studies correlating structural observations with the effector function of IgGs have been  published [61]. The idea of passive functional regulation through the Fc‐glycan structure has already  been shaped [8,11,13,17]. The present study aims at the systematic comparison of common N‐glycan  variants. By means of in vitro glyco‐engineering (IVGE), highly comparable samples, varying only  through their defined glycan structure, were generated (Figure 1) [23]. Compared to trastuzumab  starting material, no substantial chemical modifications or structural degradations of the primary  structure were found to be induced by the enzymatic treatment (Tables 2 and 3).  We recently presented a targeted H/DX‐MS approach to monitor minor structural alterations,  wherein  reliable  assignments  of  H/DX  differences  resulting  from  methionine  oxidation  were  demonstrated. M252‐ox levels to <5% could be differentiated, and as such, the impact of methionine  oxidation cannot be excluded here entirely [43]. However, no correlation between the oxidation levels  and the D uptake trends observed here could be established. The H/DX‐MS approach described was  utilized  here  to  compare  overall  seven  glyco‐variants.  After  10  min  of  deuterium  incubation,  significant uptake differences could be attributed to the individual glycan structures (Figure 2). We  merged three internally normalized data sets for direct comparison and were able to demonstrate  high method robustness (Figure 3).  Whereas no exchange differences could be established for the antibody light chain (Figure S1)  or Fab part of the heavy chain, five regions exhibiting differential uptake were identified in the heavy  chain Fc part (including the C’E loop area, which could only be analyzed for equal glycosylations).  Minor changes could be determined for the Cγ3 domain, with the BC‐loop region VKGFYPSDIAVE  (aa369–380) of the de‐glycosylated and both sialylated variants incorporating slightly less deuterium  than the RM (Figure 2a). Differential H/DX in this region has not previously been described in the  literature. However, the main uptake differences observed here were within the Cγ2 domain, which  is  consistent  with  previous  reports  investigating  antibody  glyco‐variants  [17,21,44–46].  The  Cγ2  domain  regions  revealing  differential  uptake  with  our  glyco‐variant  panel  correspond  to  the  A‐ strand, AB‐helix, B‐strand, and BC‐loop (Figure 2c–h and Figure 3a). Specifically, the domain regions  LGGPSVF  (aa235–241),  FLFPPKPKDTLM  (aa241–252)  and  VVVDVSHEDPEVKFNW  (aa262–277)  showed  differential  exchange,  confirmed  by  overlapping  peptides  (Figure  3a).  Since  the  peptide  aa266–277 exhibited no significant exchange differences, the differences observed for the peptide  aa262–277 can be attributed to its VVVD segment (V262–D265) by subtraction.  H/DX differences upon de‐glycosylation have been extensively investigated, with the region  L235–M252  described  [44,45].  Subsequent  loss  of  the  antibody  effector  function  has  also  been  observed for fully glycan truncated Fc [17,19,56–58]. Our data confirms this, with de‐glycosylated  trastuzumab incorporating more deuterium in the regions L235–F241, F241–M252 and V262–D265  (Figure 2) and showing loss of effector function (Figure 4).  Fang  et  al.  reported  increased  D  uptake  for  IgG2  high  mannose  variants  compared  with  heterogeneous glycan samples (~60% G0F, ~30% G1F, and ~4% G2F). They identified the peptides  F241–M252 and V263–F275, which correspond to our peptides FLFPPKPKDTLM (aa241–252) and  VVDVSHEDPEVKFNW  (aa263–277),  shown  in  Figure  3a  [21].  The  results  from  More  et  al.  augmented these findings and also showed uptake differences for the hinge‐Cγ2 interface and Cγ3  domain peptides, in their comparison of IgG1 de‐glycosylated, GlcNAc, and Man5 variants with high  mannose (Man5‐Man9) material [46]. We generated a sample with ~90% Fc Man5 and demonstrated  increased deuterium incorporation compared to the isolated G0F, G2F, and G2S2F variants, and the  heterogeneous  RM  fraction  in  the  areas  described  by  Fang  and  colleagues  (Figure  3a–b)  [21].  Furthermore, we demonstrate an increased D uptake for the peptide LGGPSVF (aa235–241), an area  described to have differential uptake behavior by More et al. 2018 [46]. A functional correlation with  fucosylated high mannose mAb has not been reported in the literature and was also not addressed  in our study. The previously reported increase in FcγRIII binding and in vitro ADCC has only been  demonstrated for afucosylated high mannose variants [62–64]. Our data suggests no relevant fucose‐ initiated interactions to be determining for the Fc dynamics, thus pre‐defining an optimal binding  interface for FcγR interaction. This supports the concept of steric hindrance by the core fucose during  Antibodies 2019, 8, 49  14  of  19  FcγRIIIa interaction [3]. Moreover, an increase in serum clearance of high mannose variants has been  reported  [65].  HD/X  interaction  studies  with  mannose  receptors,  FcRn  and  FcγR,  could  provide  further clarification on this topic.  The H/D exchange behavior of our enriched G0F sample (~80% G0F) was quite comparable to  trastuzumab RM (~40% G0F, ~40% G1F, and ~10% G2F) although it did show slightly more D uptake;  i.e.,  less  reduction  in  H/DX  (Figure  3a).  This  appears  to  be  reasonable  in  light  of  the  decreased  exchange observed for the trastuzumab G2F variant (Figure 3c). G2F (~85% G2F) with two additional  galactose units, showed significantly less deuterium incorporation for the region FLFPPKPKDTLM  (aa241–252), plus significantly enhanced FcγRIIIa binding (Figure 4e–f). These findings are consistent  with previous studies. Houde et al. reported the same peptide to exchange more hydrogen upon  galactosylation [17]. Due to peptic peptide overlaps, they were able to assign the increased H/DX to  the backbone amides of the residues L243, F244, and K247 (according to EU numbering [4]: L242,  F243, and K246). Further they reported a strong increase in relative binding to FcγRIIIa upon hyper‐ galactosylation. Krapp et al. also describe a stable GlcNAc–F241 interaction [11]. Our data conforms  both of those proposed interactions, with an uptake difference between G0F and G2F for aa241–252  but  not  for  aa235–241  (Figure  3c).  Subedi  et  al.  further  reported  that  F241/F243  mutations  were  impaired FcγR binding exclusively in the presence of terminal galactoses [9]. A potential explanation  is that α‐1,6‐arm Gal preferentially interacts with F241/243. The glycan α‐1,6‐arm is described to be  critical for protein surface contacts and has been simulated to adopt a “foldover” conformation upon  galactosylation, whilst the α‐1,3‐arm extends between the Cγ2 domains in an “outstretched” and  more rigid fashion [8,20,35].  We further present two highly sialylated but distinct trastuzumab glyco‐variants comprised of  ~60% α‐2,3‐linked G2S2F (ST3) or ~40% α‐2,6‐linked G2S2F (ST6), as the main component (Table 1).  The  ST6  variant  showed  relatively  comparable  H/DX  behavior  to  the  G2F  variant,  revealing,  however, the overall least exchange of all glycan variants investigated (Figure 3a). In parallel, the ST6  variant exhibited the highest binding activity in most of the functional assays (Figure 4b–e). No effect  of  terminal  sialic  acids  on  the  binding  affinity  to  Fcγ  receptors  has  been  reported  [23,26,33,34].  Further, the association of overall decreasing Cγ2 stability with decreasing glycan size [11,15,46] is in  contrast  to  results  presented  by  Ahmed  et  al.  2014  for  the α‐2,6  variant  investigated  [30].  The  comparative results of the ST6 variant in our results indicate a positive correlation between stability  of the Cγ2 region, as reflected by reduced H/DX, and enhanced functional activity. The differential  exchange for the aa241–252 peptide between G2F and ST6 (Figure 3a) further supports the concept of  dynamic modulation by differential glycan–protein and glycan–glycan interactions. In addition, an  enhanced ADCC activity for the α‐2,6‐sialylated G2S2F variant has been reported the most recently  [54].  The  finding  of  decreased  H/DX  for  doubly α‐2,6‐sialylated  Fc  glycan  structures  has  not  previously been described in literature and potentially throws a new light on the subject matter of  anti‐inflammatory IVIGs [66]. Our results indicate that the Cγ2 (and Cγ3) dynamics are not the only  determining factor for specific and functional‐defining interactions, as proposed for anti and pro‐ inflammatory effector functions, and consistent with previous work associating the lack of fucose  with subsequently closer carbohydrate contacts [3,67]. Potentially, the sialic acid itself plays a crucial  role in anti‐inflammatory receptor binding, as observed for the SIGN‐R1 [28].  For the α‐2,3‐linked sialic acid variant, D uptake differences could be observed for all of the  aforementioned Cγ2 domain areas L235–F241, F241–M252, and V262–W277 (Figure 5c–m). While the  peptide FLFPPKPKDTLM (aa241–252) showed an H/DX comparable to the mixed fraction RM, the  peptides  LGGPSVF  (aa235–241)  and  the  VVVD  (aa262–265)  segment  showed  more  exchange  compared to the RM (Figure 3a). The kind of linkage, therefore, can be shown to affect the H/DX  kinetics. This trend was able to be further confirmed within an H/DX time survey (Figure 5a). The  described areas exchanged relatively slowly (maximum H/DX difference about 10–30 min). Faster  backbone  hydrogen  exchange  was  observed  for  the  additional  glyco‐peptide  region  Y278–N325  (maximum  H/DX  difference  ~1  min);  e.g.,  for  the  peptide  VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL  (aa282–306) shown in Figure 5r. Very likely, the uptake is favored by the seven accessible acetamido  groups of the G2S2F structure. However, the differential uptake of the glycan itself already reveals  Antibodies 2019, 8, 49  15  of  19  information about the glycan–glycan and glycan–protein interactions. We propose the α‐2,6‐structure  is more shielded, due to (H‐bonding) interactions (less H/DX), compared to the α‐2,3‐structure (more  H/DX). The H/DX of the amide backbone of the C’E‐loop peptides and the attached glycan structures  cannot be differentiated. However, the large D uptake difference for the overall peptide does indicate  an increased motion of the C’E‐loop area for the α‐2,3‐linked G2S2F variant, which is proposed to  determine the FcγR binding interface [5,11,13]. This would explain differential receptor interactions  described for differentially linked sialic acids; e.g., for the CD22 binding [68]. Moreover, Anthony et  al. recognized that IgG Fc α‐2,3‐linked sialic acid structures did not exhibit an anti‐inflammatory  potential [28,66]. This also correlates well with observations made by Falck and colleagues who report  α‐2,3‐linked G2S1F IgG to be significantly more susceptible to tryptic digestion than α‐2,6‐linked  G2S1F IVIGs [69]. The levels of the corresponding singly sialylated molecules in our samples were  ~14% G2S1F (ST3) and ~27% G2S1F (ST6), respectively. In accordance with reports on differential  sialylation of the bi‐antennary glycan arms [70], we obtained about twice as much singly sialylated  molecules for the α‐2,6‐linked variant compared to the α‐2,3‐linked version. A possible explanation  could be an increased accessibility for the α‐2,3‐sialyltransferase due to decreased interaction of the  ST3  glycan  structure  (predominantly  the α‐1,6‐arm)  with  the  protein  surface.  Indeed,  our  H/DX  results support this assumption. The differing ratio of G2S1F/G2S2F for the two differentially linked  sialic acid samples should also be considered in context of the observed results. With less conjugated  sialic acids, more galactoses would be accessible to interact with the protein surface. In a recently  published in silico study, Harbison et al. were able to show increased conformational freedom for α‐ 2,6‐linkages,  as  shown  for  an  isolated  G2S2F  glycan  structure  [35].  Our  results  suggest  (steric)  hindrance of galactose interactions with the protein surface by the comparably short O‐glycosidic  linkage of the galactose C3 hydroxy‐group and the sialic acid, e.g., the Gal interaction with K246 as  presented by Houde et al. 2010. In contrast, the O‐glycosidic linkage between the C6 hydroxymethyl‐ group (CH2OH) and the sialic acid protrudes out of the cyclic hexose conformation, which would  yield a higher conformational degree of freedom [35].  5. Conclusions  Here, we present a combined approach of in vitro glyco‐engineering and H/DX‐MS to assess the  impact of Fc glycosylation on higher‐order structure (HOS). We were able to confirm significantly  distinguishable  uptake  trends  towards  lower  exchange  rates  for  larger  glycan  structures.  As  an  exception we found the G2S2F structure with terminal α‐2,3‐linked sialic acids to incorporate more  deuterium  compared  to  the α‐2,6‐linked  sialic  acid  structure.  A  strong  structure  to  function  correlation between the H/DX and SPR data could be verified and highlights the important role of  the terminal sialic acid linkage. As indicated by our results and as already suggested in other studies,  the antibody backbone dynamics are most likely stabilized due to inter‐glycan and glycan–protein  interactions.  Proposed  is  an  overall  entropic  modulation  towards  an  optimal  binding  interface.  Described factors are the Cγ2 domain orientation and site‐specific interactions, whereof the former  is suggested to depend on the inter‐glycan interactions and the latter on glycan–protein interactions.  A key role has been ascribed to the fluctuation of the C’E‐loop. Its motion supposedly depends on  the Cγ2 dynamics and is again determined by certain secondary structure events.  Our results support this assumption. With more interactions favored by the individual structure,  the overall backbone motion/accessibility decreases. The interactions facilitated by sialic acids and  the mechanism for domain destabilization caused by the α‐2,3‐linkage of the terminal sugar should  be further experimentally addressed. Our results show there is no strict correlation between Fc glycan  size and resulting Cγ2 flexibility, with linkage, and hence, steric factors also contributing.  Supplementary Materials: The following are available online at www.mdpi.com/, Figure S1: Reduction in H/DX  (%) of trastuzumab glycan variant peptides (whole sequence); Figure S2: Uptake difference plot with D uptake  (Da) of alternatively linked trastuzumab sialylation variants (light chain only); Figure S3: Volcano plot showing  statistical significance testing of trastuzumab ST3 and ST6 D uptake differences; Table S1: D uptake differences  and reduction in H/DX values; Table S2: Relative FcγR binding of trastuzumab glycan variants; Table S3: D  uptake differences of trastuzumab G2S2F ST3 versus ST6.  Antibodies 2019, 8, 49  16  of  19  Author Contributions: Conceptualization, F.K., M.M., and P.B.; data curation, F.K.; formal analysis, F.K. and  F.C.; investigation, F.K., L.B., S.M., C.A., and H.W.; methodology, F.K., L.B., S.M., M.T., C.A., F.C., and D.R.;  project  administration,  H.W.  and  P.B.;  resources,  H.W.  and  D.R.;  supervision,  L.B.,  M.T.,  M.M.,  and  P.B.;  visualization, F.K.; writing—original draft, F.K.; writing—review and editing, L.B., M.M., and P.B.  Funding: This research received no external funding.  Acknowledgments: We are grateful to Cornelia Wagner and Hubert Kettenberger of Roche Pharma Research  and  Early  Development  (pRED)  for  sharing  their  scientific  and  technical  knowledge  on  H/DX  and  MD  respectively; Florian Seefried for data analysis support; Christian Goesswald for glycan quantification; and all  members of the laboratories at Roche Penzberg (Germany) for their general assistance and cooperation.  Conflicts of Interest: F.K., L.B., S.M., M.T., H.W., D.R. and P.B. are employees of Roche Diagnostics GmbH; C.A.,  F.C. and H.W. are employees of F. Hoffmann‐La Roche Ltd. The authors declare no conflict of interest.  References  1. Beck, A.; Reichert, J.M. Marketing approval of mogamulizumab: A triumph for glyco‐engineering. MAbs  2012, 4, 419–425.  2. Shields, R.L.; Lai, J.; Keck, R.; O’Connell, L.Y.; Hong, K.; Meng, Y.G.; Weikert, S.H.; Presta, L.G. Lack of  fucose on human igg1 n‐linked oligosaccharide improves binding to human fcgamma riii and antibody‐ dependent cellular toxicity. J. Biol. Chem. 2002, 277, 26733–26740.  3. Ferrara, C.; Grau, S.; Jager, C.; Sondermann, P.; Brunker, P.; Waldhauer, I.; Hennig, M.; Ruf, A.; Rufer, A.C.;  Stihle,  M.;  et  al.  Unique  carbohydrate‐carbohydrate  interactions  are  required  for  high  affinity  binding  between fcgammariii and antibodies lacking core fucose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011, 108, 12669–12674.  4. Edelman, G.M.; Cunningham, B.A.; Gall, W.E.; Gottlieb, P.D.; Rutishauser, U.; Waxdal, M.J. The covalent  structure of an entire gammag immunoglobulin molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1969, 63, 78–85.  5. Sondermann,  P.;  Huber,  R.;  Oosthuizen,  V.;  Jacob,  U.  The  3.2‐a  crystal  structure  of  the  human  igg1  fc  fragment‐fc gammariii complex. Nature 2000, 406, 267–273.  6. Barb, A.W.; Meng, L.; Gao, Z.; Johnson, R.W.; Moremen, K.W.; Prestegard, J.H. Nmr characterization of  immunoglobulin g fc glycan motion on enzymatic sialylation. Biochemistry 2012, 51, 4618–4626.  7. Radaev, S.; Motyka, S.; Fridman, W.H.; Sautes‐Fridman, C.; Sun, P.D. The structure of a human type iii  fcgamma receptor in complex with fc. J. Biol. Chem. 2001, 276, 16469–16477.  8. Frank,  M.;  Walker,  R.C.;  Lanzilotta,  W.N.;  Prestegard,  J.H.;  Barb,  A.W.  Immunoglobulin  g1  fc  domain  motions: Implications for fc engineering. J. Mol. Biol. 2014, 426, 1799–1811.  9. Subedi, G.P.; Hanson, Q.M.; Barb, A.W. Restricted motion of the conserved immunoglobulin g1 n‐glycan  is essential for efficient fcgammariiia binding. Structure 2014, 22, 1478–1488.  10. Yu,  X.;  Baruah,  K.;  Harvey,  D.J.;  Vasiljevic,  S.;  Alonzi,  D.S.;  Song,  B.D.;  Higgins,  M.K.;  Bowden,  T.A.;  Scanlan,  C.N.;  Crispin,  M.  Engineering  hydrophobic  protein‐carbohydrate  interactions  to  fine‐tune  monoclonal antibodies. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 9723–9732.  11. Krapp,  S.;  Mimura,  Y.;  Jefferis,  R.;  Huber,  R.;  Sondermann,  P.  Structural  analysis  of  human  igg‐fc  glycoforms reveals a correlation between glycosylation and structural integrity. J. Mol. Biol. 2003, 325, 979– 989.  12. Feige, M.J.; Nath, S.; Catharino, S.R.; Weinfurtner, D.; Steinbacher, S.; Buchner, J. Structure of the murine  unglycosylated igg1 fc fragment. J. Mol. Biol. 2009, 391, 599–608.  13. Subedi, G.P.; Barb, A.W. The structural role of antibody n‐glycosylation in receptor interactions. Structure  2015, 23, 1573–1583.  14. Mimura, Y.; Church, S.; Ghirlando, R.; Ashton, P.R.; Dong, S.; Goodall, M.; Lund, J.; Jefferis, R. The influence  of glycosylation on the thermal stability and effector function expression of human igg1‐fc: Properties of a  series of truncated glycoforms. Mol. Immunol. 2000, 37, 697–706.  15. Buck, P.M.; Kumar, S.; Singh, S.K. Consequences of glycan truncation on fc structural integrity. MAbs 2013,  5, 904–916.  16. Deisenhofer, J. Crystallographic refinement and atomic models of a human fc fragment and its complex  with fragment b of protein a from staphylococcus aureus at 2.9‐ and 2.8‐a resolution. Biochemistry 1981, 20,  2361–2370.  17. Houde, D.; Peng, Y.; Berkowitz, S.A.; Engen, J.R. Post‐translational modifications differentially affect igg1  conformation and receptor binding. Mol. Cell. Proteom. 2010, 9, 1716–1728.  Antibodies 2019, 8, 49  17  of  19  18. Yamaguchi,  Y.;  Nishimura,  M.;  Nagano,  M.;  Yagi,  H.;  Sasakawa,  H.;  Uchida,  K.;  Shitara,  K.;  Kato,  K.  Glycoform‐dependent conformational alteration of the fc region of human immunoglobulin g1 as revealed  by nmr spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1760, 693–700.  19. Lund,  J.;  Tanaka,  T.;  Takahashi,  N.;  Sarmay,  G.;  Arata,  Y.;  Jefferis,  R.  A  protein  structural  change  in  aglycosylated igg3 correlates with loss of hufc gamma r1 and hufc gamma r111 binding and/or activation.  Mol. Immunol. 1990, 27, 1145–1153.  20. Wormald,  M.R.;  Rudd,  P.M.;  Harvey,  D.J.;  Chang,  S.C.;  Scragg,  I.G.;  Dwek,  R.A.  Variations  in  oligosaccharide‐protein interactions in immunoglobulin g determine the site‐specific glycosylation profiles  and modulate the dynamic motion of the fc oligosaccharides. Biochemistry 1997, 36, 1370–1380.  21. Fang, J.; Richardson, J.; Du, Z.; Zhang, Z. Effect of fc‐glycan structure on the conformational stability of igg  revealed by hydrogen/deuterium exchange and limited proteolysis. Biochemistry 2016, 55, 860–868.  22. Thomann, M.; Reckermann, K.; Reusch, D.; Prasser, J.; Tejada, M.L. Fc‐galactosylation modulates antibody‐ dependent cellular cytotoxicity of therapeutic antibodies. Mol. Immunol. 2016, 73, 69–75.  23. Thomann, M.; Schlothauer, T.; Dashivets, T.; Malik, S.; Avenal, C.; Bulau, P.; Ruger, P.; Reusch, D. In vitro  glycoengineering  of  igg1  and  its  effect  on  fc  receptor  binding  and  adcc  activity.  PLoS  ONE  2015,  10,  e0134949.  24. Parekh,  R.B.;  Dwek,  R.A.;  Sutton,  B.J.;  Fernandes,  D.L.;  Leung,  A.;  Stanworth,  D.;  Rademacher,  T.W.;  Mizuochi,  T.;  Taniguchi,  T.;  Matsuta,  K.;  et  al.  Association  of  rheumatoid  arthritis  and  primary  osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum igg. Nature 1985, 316, 452–457.  25. Nimmerjahn,  F.;  Ravetch,  J.V.  Anti‐inflammatory  actions  of  intravenous  immunoglobulin.  Annu.  Rev.  Immunol. 2008, 26, 513–533.  26. Kaneko, Y.; Nimmerjahn, F.; Ravetch, J.V. Anti‐inflammatory activity of immunoglobulin g resulting from  fc sialylation. Science 2006, 313, 670–673.  27. Anthony, R.M.; Ravetch, J.V. A novel role for the igg fc glycan: The anti‐inflammatory activity of sialylated  igg fcs. J. Clin. Immunol. 2010, 30 (Suppl. S1), S9–S14.  28. Anthony, R.M.; Wermeling, F.; Karlsson, M.C.; Ravetch, J.V. Identification of a receptor required for the  anti‐inflammatory activity of ivig. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105, 19571–19578.  29. Arnold,  J.N.;  Wormald,  M.R.;  Sim,  R.B.;  Rudd,  P.M.;  Dwek,  R.A.  The  impact  of  glycosylation  on  the  biological function and structure of human immunoglobulins. Annu. Rev. Immunol. 2007, 25, 21–50.  30. Ahmed, A.A.; Giddens, J.; Pincetic, A.; Lomino, J.V.; Ravetch, J.V.; Wang, L.X.; Bjorkman, P.J. Structural  characterization of anti‐inflammatory immunoglobulin g fc proteins. J. Mol. Biol. 2014, 426, 3166–3179.  31. Scallon,  B.J.;  Tam,  S.H.;  McCarthy,  S.G.;  Cai,  A.N.;  Raju,  T.S.  Higher  levels  of  sialylated  fc  glycans  in  immunoglobulin g molecules can adversely impact functionality. Mol. Immunol. 2007, 44, 1524–1534.  32. Naso, M.F.; Tam, S.H.; Scallon, B.J.; Raju, T.S. Engineering host cell lines to reduce terminal sialylation of  secreted antibodies. MAbs 2010, 2, 519–527.  33. Kapur,  R.;  Einarsdottir,  H.K.;  Vidarsson,  G.  Igg‐effector  functions:  “The  good,  the  bad  and  the  ugly”.  Immunol. Lett. 2014, 160, 139–144.  34. Stadlmann, J.;  Pabst,  M.;  Altmann, F.  Analytical  and functional  aspects  of antibody  sialylation.  J.  Clin.  Immunol. 2010, 30 (Suppl. S1), S15–S19.  35. Harbison, A.M.; Brosnan, L.P.; Fenlon, K.; Fadda, E. Sequence‐to‐structure dependence of isolated igg fc  complex biantennary n‐glycans: A molecular dynamics study. Glycobiology 2019, 29, 94–103.  36. Konermann,  L.;  Tong,  X.;  Pan,  Y.  Protein  structure  and  dynamics  studied  by  mass  spectrometry:  H/d  exchange, hydroxyl radical labeling, and related approaches. J. Mass Spectrom. 2008, 43, 1021–1036.  37. Houde, D.; Berkowitz, S.A.; Engen, J.R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in  biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 2011, 100, 2071–2086.  38. Huang,  R.Y.;  Chen,  G.  Higher  order  structure  characterization  of  protein  therapeutics  by  hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2014, 406, 6541–6558.  39. Burkitt,  W.;  Domann,  P.;  O’Connor,  G.  Conformational  changes  in  oxidatively  stressed  monoclonal  antibodies studied by hydrogen exchange mass spectrometry. Protein Sci. 2010, 19, 826–835.  40. Zhang, A.; Hu, P.; MacGregor, P.; Xue, Y.; Fan, H.; Suchecki, P.; Olszewski, L.; Liu, A. Understanding the  conformational  impact  of  chemical  modifications  on  monoclonal  antibodies  with  diverse  sequence  variation using hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry and structural modeling. Anal. Chem.  2014, 86, 3468–3475.  Antibodies 2019, 8, 49  18  of  19  41. Mo, J.; Yan, Q.; So, C.K.; Soden, T.; Lewis, M.J.; Hu, P. Understanding the impact of methionine oxidation  on the biological functions of igg1 antibodies using hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.  Anal. Chem. 2016, 88, 9495–9502.  42. Yan, Y.; Wei, H.; Fu, Y.; Jusuf, S.; Zeng, M.;  Ludwig, R.; Krystek, S.R., Jr.; Chen, G.; Tao,  L.; Das,  T.K.  Isomerization and oxidation  in  the  complementarity‐determining regions  of a  monoclonal antibody: A  study  of  the  modification‐structure‐function  correlations  by  hydrogen‐deuterium  exchange  mass  spectrometry. Anal. Chem. 2016, 88, 2041–2050.  43. Bonnington, L.; Lindner, I.; Gilles, U.; Kailich, T.; Reusch, D.; Bulau, P. Application of hydrogen/deuterium  exchange‐mass  spectrometry  to  biopharmaceutical  development  requirements:  Improved  sensitivity  to  detection of conformational changes. Anal. Chem. 2017, 89, 8233–8237.  44. Houde, D.; Arndt, J.; Domeier, W.; Berkowitz, S.; Engen, J.R. Characterization of igg1 conformation and  conformational dynamics by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 2009, 81, 5966.  45. Jensen,  P.F.;  Larraillet,  V.;  Schlothauer,  T.;  Kettenberger,  H.;  Hilger,  M.;  Rand,  K.D.  Investigating  the  interaction between the neonatal fc receptor and monoclonal antibody variants by hydrogen/deuterium  exchange mass spectrometry. Mol. Cell. Proteom. 2015, 14, 148–161.  46. More, A.S.; Toth, R.T.T.; Okbazghi, S.Z.; Middaugh, C.R.; Joshi, S.B.; Tolbert, T.J.; Volkin, D.B.; Weis, D.D.  Impact of glycosylation on the local backbone flexibility of well‐defined igg1‐fc glycoforms using hydrogen  exchange‐mass spectrometry. J. Pharm. Sci. 2018, 107, 2315–2324.  47. Zhang, A.; Fang, J.; Chou, R.Y.; Bondarenko, P.V.; Zhang, Z. Conformational difference in human igg2  disulfide isoforms revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Biochemistry 2015, 54,  1956–1962.  48. Iacob,  R.E.;  Bou‐Assaf,  G.M.;  Makowski,  L.;  Engen,  J.R.;  Berkowitz,  S.A.;  Houde,  D.  Investigating  monoclonal antibody aggregation using a combination of h/dx‐ms and other biophysical measurements. J.  Pharm. Sci. 2013, 102, 4315–4329.  49. Chalmers, M.J.; Busby, S.A.; Pascal, B.D.; He, Y.; Hendrickson, C.L.; Marshall, A.G.; Griffin, P.R. Probing  protein ligand interactions by automated hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem.  2006, 78, 1005–1014.  50. Ruiz,  F.M.;  Gilles,  U.;  Lindner,  I.;  Andre,  S.;  Romero,  A.;  Reusch,  D.;  Gabius,  H.J.  Combining  crystallography and hydrogen‐deuterium exchange to study galectin‐ligand complexes. Chemistry 2015, 21,  13558–13568.  51. Reusch, D.; Haberger, M.; Maier, B.; Maier, M.; Kloseck, R.; Zimmermann, B.; Hook, M.; Szabo, Z.; Tep, S.;  Wegstein,  J.;  et  al.  Comparison  of  methods  for  the  analysis  of  therapeutic  immunoglobulin  g  fc‐ glycosylation profiles—Part 1: Separation‐based methods. MAbs 2015, 7, 167–179.  52. Schmid, I.; Bonnington, L.; Gerl, M.; Bomans, K.; Thaller, A.L.; Wagner, K.; Schlothauer, T.; Falkenstein, R.;  Zimmermann, B.; Kopitz, J.; et al. Assessment of susceptible chemical modification sites of trastuzumab  and endogenous human immunoglobulins at physiological conditions. Commun. Biol. 2018, 1, 28.  53. Diepold, K.; Bomans, K.; Wiedmann, M.; Zimmermann, B.; Petzold, A.; Schlothauer, T.; Mueller, R.; Moritz,  B.; Stracke, J.O.; Molhoj, M.; et al. Simultaneous assessment of asp isomerization and asn deamidation in  recombinant antibodies by lc‐ms following incubation at elevated temperatures. PLoS ONE 2012, 7, e30295.  54. Thomann, M.; Malik, S.; Kuhne, F.; Avenal, C.; Plath, F.; Bonnington, L.; Reusch, D.; Bulau, P.; Cymer, F.  Effects of sialic acid linkage on antibody‐fragment crystallizable receptor binding and antibody dependent  cytotoxicity depend on levels of fucosylation/bisecting. Bioanalysis 2019, 11, 1437–1449.  55. Guttman, M.; Scian, M.; Lee, K.K. Tracking hydrogen/deuterium exchange at glycan sites in glycoproteins  by mass spectrometry. Anal. Chem. 2011, 83, 7492–7499.  56. Boyd, P.N.; Lines, A.C.; Patel, A.K. The effect of the removal of sialic acid, galactose and total carbohydrate  on the functional activity of campath‐1h. Mol. Immunol. 1995, 32, 1311–1318.  57. Mimura,  Y.;  Sondermann,  P.;  Ghirlando,  R.;  Lund,  J.;  Young,  S.P.;  Goodall,  M.;  Jefferis,  R.  Role  of  oligosaccharide residues of igg1‐fc in fc gamma riib binding. J. Biol. Chem. 2001, 276, 45539–45547.  58. Radaev, S.; Sun, P. Recognition of immunoglobulins by fcgamma receptors. Mol. Immunol. 2002, 38, 1073– 1083.  59. Kabat, E.A.; Wu, T.T.; Perry, H.; Gottesman, K.; Foeller, C. Sequences of Proteins of Immunological Interest;  NIH Publication: Bethesda, MD, USA; 1991.  Antibodies 2019, 8, 49  19  of  19  60. Hageman,  T.S.;  Weis,  D.D.  Reliable  identification  of  significant  differences  in  differential  hydrogen  exchange‐mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Anal. Chem. 2019,  91, 8008–8016.  61. Kiyoshi,  M.;  Tsumoto,  K.;  Ishii‐Watabe,  A.;  Caaveiro,  J.M.M.  Glycosylation  of  igg‐fc:  A  molecular  perspective. Int. Immunol. 2017, 29, 311–317.  62. Yu,  M.;  Brown,  D.;  Reed,  C.;  Chung,  S.;  Lutman,  J.;  Stefanich,  E.;  Wong,  A.;  Stephan,  J.P.;  Bayer,  R.  Production,  characterization,  and  pharmacokinetic  properties  of  antibodies  with  n‐linked  mannose‐5  glycans. MAbs 2012, 4, 475–487.    S.B.;  Middaugh, C.R.;  Volkin,  D.B.;  63. Okbazghi, S.Z.;  More,  A.S.;  White,  D.R.; Duan,  S.; Shah,  I.S.;  Joshi, Tolbert, T.J. Production, characterization, and biological evaluation of well‐defined igg1 fc glycoforms as a  model system for biosimilarity analysis. J. Pharm. Sci. 2016, 105, 559–574.  64. Kanda, Y.; Yamada, T.; Mori, K.; Okazaki, A.; Inoue, M.; Kitajima‐Miyama, K.; Kuni‐Kamochi, R.; Nakano,  R.; Yano, K.; Kakita, S.; et al. Comparison of biological activity among nonfucosylated therapeutic igg1  antibodies with three different n‐linked fc oligosaccharides: The high‐mannose, hybrid, and complex types.  Glycobiology 2007, 17, 104–118.  65. Goetze, A.M.; Liu, Y.D.; Zhang, Z.; Shah, B.; Lee, E.; Bondarenko, P.V.; Flynn, G.C. High‐mannose glycans  on the fc region of therapeutic igg antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology 2011, 21,  949–959.  66. Anthony, R.M.; Nimmerjahn, F.; Ashline, D.J.; Reinhold, V.N.; Paulson, J.C.; Ravetch, J.V. Recapitulation  of ivig anti‐inflammatory activity with a recombinant igg fc. Science 2008, 320, 373–376.  67. Shields, R.L.; Namenuk, A.K.; Hong, K.; Meng, Y.G.; Rae, J.; Briggs, J.; Xie, D.; Lai, J.; Stadlen, A.; Li, B.; et  al. High resolution mapping of the binding site on human igg1 for fc gamma ri, fc gamma rii, fc gamma  riii, and fcrn and design of igg1 variants with improved binding to the fc gamma r. J. Biol. Chem. 2001, 276,  6591–6604.  68. Powell,  L.D.;  Sgroi,  D.;  Sjoberg,  E.R.;  Stamenkovic,  I.;  Varki, A.  Natural  ligands  of the  b  cell  adhesion  molecule cd22 beta carry n‐linked oligosaccharides with alpha‐2,6‐linked sialic acids that are required for  recognition. J. Biol. Chem. 1993, 268, 7019–7027.  69. Falck, D.; Jansen, B.C.; Plomp, R.; Reusch, D.; Haberger, M.; Wuhrer, M. Glycoforms of immunoglobulin g  based biopharmaceuticals are differentially cleaved by trypsin due to the glycoform influence on higher‐ order structure. J. Proteome Res. 2015, 14, 4019–4028.  70. Barb,  A.W.;  Brady,  E.K.;  Prestegard,  J.H.  Branch‐specific  sialylation  of  igg‐fc  glycans  by  st6gal‐i.  Biochemistry 2009, 48, 9705–9707.  © 2019 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access  article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution  (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 

Journal

Antibodies – Multidisciplinary Digital Publishing Institute

Published: Oct 1, 2019

There are no references for this article.