Get 20M+ Full-Text Papers For Less Than $1.50/day. Start a 14-Day Trial for You or Your Team.

Learn More →

Root and Agro-Morphological Traits Performance in Cowpea under Drought Stress

Root and Agro-Morphological Traits Performance in Cowpea under Drought Stress Article  Root and Agro‐Morphological Traits Performance in  Cowpea under Drought Stress  1,† 2, ,† 1,2 2,3 Ricardo Santos  , Márcia Carvalho  * , Eduardo Rosa  , Valdemar Carnide     2,3 and Isaura Castro      Department of Agronomy, University of Trás‐os‐Montes and Alto Douro (UTAD), 5000‐801 Vila Real, Portugal;  santos.ricj@gmail.com (R.S.); erosa@utad.pt (E.R.)    Centre for Research and Technology of Agro‐Environment and Biological Sciences (CITAB),   University of Trás‐os‐Montes and Alto Douro (UTAD), 5000‐801 Vila Real, Portugal;   vcarnide@utad.pt (V.C.); icastro@utad.pt (I.C.)    Department of Genetics and Biotechnology, University of Trás‐os‐Montes and Alto Douro (UTAD),   5000‐801 Vila Real, Portugal  *  Correspondence: marciac@utad.pt  †  Co‐first authors (R.S. and M.C.).  Received: 17 September 2020; Accepted: 15 October 2020; Published: 20 October 2020  Abstract: Drought is responsible for major yield losses in many worldwide crops and is expected to  occur more frequently due to climate change. Cowpea, one of the most drought tolerant legumes,  stands as a promising crop in the future climatic context. The screening for genotypes well adapted  to this constraint is an  essential step  to  improve  cowpea  production.  A  collection  of 29  cowpea  genotypes  (Vigna  unguiculata  L.  Walp.)  from  the  Iberian  Peninsula  and  11  other  countries  from  worldwide regions was grown and submitted to drought stress using pipes with 30 cm (control)  and 90 cm (stress) of height in which water was supplied through the bottom. A set of root and agro‐ morphological parameters were evaluated, including shoot and root dry weight, root:shoot ratio  and stem greenness. Overall, results show that under drought stress, plants seem to invest in root  development and reduce shoot biomass. Higher root dry weight under drought conditions could  be related to a higher drought tolerance in cowpea. Based on the evaluated traits, it was possible to  identify  genotypes,  particularly  C47  (Iran),  C56  and  C11  (Portugal),  which  might  represent  promising cowpea genetic resources for improved drought tolerance breeding.  Keywords:  Vigna  unguiculata  L.  Walp;  drought  stress  tolerance;  legumes  diversity;  genetic  resources; landraces; phenotypic descriptors; water scarcity; Southern European agriculture  1. Introduction  Climate change predictions point towards an increase in extreme events in the coming years,  namely long periods of drought [1]. Drought causes yield losses in major agricultural crops [2]. Since  the global population is expected to reach over 9 billion people by 2050, agricultural systems are  required to be more productive and to assure sustainable food production under the expected climate  challenges [3].  Cowpea is an important crop in semi‐arid tropics, particularly in Africa, the continent that is  responsible for 96.4% of worldwide production [4]. Nowadays, Europe is facing a deficit of about  70%  of  grain  legumes (including  cowpea), leading a  negative trade  scenario.  For this  reason, the  increasing  of  cowpea  production  in  Europe  is  fundamental  [5].  The  dry  and  immature  seeds,  immature  pods  and  leaves  of  cowpea  plants  can  be  consumed,  providing  a  balanced  source  of  nutrients with numerous health benefits [6]. The dry grain has high protein levels (20.0–39.4%) and  Agronomy 2020, 10, 1604; doi:10.3390/agronomy10101604  www.mdpi.com/journal/agronomy  Agronomy 2020, 10, 1604  2  of  20  low fat content (3.1–30.4%) [6,7]. As with other legumes, cowpea establishes effective symbiosis with  mycorrhizae, allowing the fixation of atmospheric nitrogen. Hence, it is presented as a key rotating  crop in farming systems with infertile soils [8]. Furthermore, cowpea is one of the most drought and  high temperature tolerant legume crops [9,10] producing high yields under terminal drought stress  conditions and requiring less water than other cultivated legume species [11]. All these characteristics  emphasize cowpea as a good opportunity to increase the sustainability of agricultural systems and  counteract climate changes. Screening genotypes that are more tolerant to drought is an important  step to improve the production of this crop under the expected future climatic constraints. The ways  by which plants cope with drought stress are displayed as a complex expression of mechanisms and  factors, thereby the screening for  drought tolerant genotypes is still a difficult task [12].  A set of  different drought tolerance parameters has been used to perform screenings in cowpea genotypes  [13–16].  Shoot  biomass  variations  under  different  drought  conditions  show  correlation  with  the  plants’ water status, in which small shoot biomass leads to less water consumption, conferring higher  drought tolerance [15].  Root traits of different crops have been suggested as an important feature related with drought  tolerance [17]. Deep root systems are important for the uptake of water from deeper soil layers in  drought  conditions  [16].  Plants  may  increase  root  length  through  different  processes  such  as  increased biomass allocation and/or promoting primary root development while suppressing lateral  root growth [17]. Some reports suggested that an increase in root mass may indicate a higher plant  capability to maintain their water status [17,18]. However, these mechanisms can reduce the plants’  yield potential [12], with it being important to also include production related traits when screening  for tolerant genotypes. The evaluation of drought tolerance mechanisms using root traits is hampered  by the complexity of the methodology involved [15].  In the present study, we evaluated the performance of 29 cowpea genotypes under drought  conditions  where  different  shoot  and  root  related  agronomic  parameters  were  evaluated.  The  objectives of this work were the selection of drought tolerant genotypes that might be particularly  important  in  the  climate  change  scenario  for  Southern  Europe  and  to  further  understand  the  relevance of root related parameters in drought tolerance screenings. These results will hopefully  contribute  to  obtaining  cowpea  genotypes  with  greater  drought  tolerance,  allowing  increased  cowpea production in Europe.  2. Materials and Methods  2.1. Plant Material and Experimental Design  A total of 29 cowpea genotypes were selected based on previous research [13,19], including one  drought susceptible and one drought tolerant genotype, Bambey21 and IT93K‐503–1, respectively.  The  genotypes  were  originated  from  worldwide  countries  with  a  particular  focus  on  Iberian  Peninsula genotypes (8 from Portugal and 8 from Spain) (Table 1). All the genotypes were previously  tested in field experiments, revealing that they have an erect growth habit [19–21].  This  study  followed  the  experimental  design  proposed  by  Iseki  et  al.  [15]  with  some  modifications. The experiment took place under open field conditions at the Universidade de Trás‐ os‐Montes e Alto Douro (41°17′10″ N 7°44′8″ E) and was divided into two stages: (a) all plants were  grown in 30 cm pipes; (b) the pipe height of half of the replicates was increased to 90 cm, to simulate  drought conditions (Figure 1). Pipes were protected by a small wire structure that allowed the sliding  of a retractable cover that was only used when it was raining, being removed as soon as it stopped.  Agronomy 2020, 10, 1604  3  of  20  Table 1. List of the cowpea genotypes used in this study including their origin and type.        #  Code Bank Code Origin Donor Institution  Type            C3 Cp 4924 Évora, Portugal INIAV Landrace           C5 Cp 5648 Abrantes, Portugal INIAV Landrace           C8 Vg 50 Pinhel, Portugal UTAD Landrace Macedo de Cavaleiros,          C11 Vg 56 UTAD Landrace Portugal           C15 Fradel Portugal INIAV Variety           C56 Vg 59 Fundão, Portugal UTAD Landrace           C57 Vg 62 Covilhã, Portugal UTAD Landrace           C58 Vg 72 Mogadouro, Portugal UTAD Landrace           C18 BGE038478 Málaga, Spain CRF‐INIA Landrace Breeding          C59 IT97K‐499‐35 Nigeria UCR line           C41 VIG 58 Angola IPK Landrace           C43 VIG 90 Egypt IPK Landrace           C45 VIG 49 Senegal IPK Landrace           C47 VIG 1649 Iran IPK Landrace           C49 VIG 206 Cuba IPK Landrace           C51 VIG 10 China IPK Landrace           C52 NI 778 India BGM Landrace Baio          C53 Brazil EMBRAPA Variety Cooafom           C19 BGE002195 Orense, Spain CRF‐INIA Landrace           C20 BGE019751 Girona, Spain CRF‐INIA Landrace           C21 BGE024703 Baleares, Spain CRF‐INIA Landrace           C22 BGE025213 Caceres, Spain CRF‐INIA Landrace           C23 BGE047731 Pontevedra, Spain CRF‐INIA Landrace           C24 BGE036461 Huelva, Spain CRF‐INIA Landrace           C29 BGE039237 Cordoba, Spain CRF‐INIA Landrace           C31 MG 113779 Puglia, Italy CRF‐INIA Landrace           C39 AUA 1 Crete, Greece AUA Landrace          References IT93K‐ Breeding        IT93K‐503‐1 Nigeria UCR     503‐1 line           Bambey21 Bambey21 Senegal UCR Cultivar   AUA—Agricultural  University  of  Athens,  Greece;  BGM—Botanic  Garden  Meise,  Belgium;  CRF‐ INIA—National  Plant  Genetic  Resources  Centre‐National  Institute  for  Agricultural  and  Food  Technology  Research,  Spain;  INIAV—Instituto  Nacional  de  Investigação  Agrária  e  Veterinária,  Portugal;  IPK—Leibniz  Institute  of  Plant  Genetics  and  Crop  Plant  Research,  Germany;  UCR— University  of  California  Riverside,  USA;  UTAD—Universidade  de  Trás‐os‐Montes  e  Alto  Douro,  Portugal.  In the first stage (Figure 1a), 6 seeds of each cowpea genotype were sowed individually in the  polyvinyl chloride (PVC) pipes, completely randomized on the 28th of June 2019. These pipes were  30 cm in height and 12.5 cm in diameter, were filled with a mixture of vermiculite, soil and peat  (1.5:3:6) and were watered to field capacity. After 30 days of plant development, the water stress was  imposed on half of the replicates by placing the 30 cm pipes on top of 60 cm pipes, previously filled  with the same soil mixture of the 30 cm pipes and watered to ensure water conductivity between both  pipes (Figure 1b). This was the timepoint for the onset of drought stress. Plants in the 30 cm pipes  and 90 cm pipes are hereafter designated as control and stress, respectively. The trial was conducted  during the next 42 days, which amounted to a final duration of 72 days since sowing took place. The  Agronomy 2020, 10, 1604  4  of  20  pipes were placed on top of a wood tray that was leveled and impermeabilized with a plastic sheet.  This made it possible to irrigate the base of the pipes with a thin layer of water during the first 35  days upon drought imposition. The bottom of the pipes had 4 holes of 0.5 cm diameter to ensure  water absorption. This prevented complete dehydration of the pipes and ensured that water would  be available in the deepest soil layers. No water was supplied in the last 7 days of the trial.  Figure  1.  Graphical  representation  of  the  experimental  trial.  Sowing  of  6  replicates  per  genotype  occurred in pipes with 30 cm in height (a). At the end of 30 days, half of the replicates in the 30 cm   height of 90 cm (b). The pipes were submerged  pipes were put on top of 60 cm pipes to obtain a final in a thin layer of water to ensure that deeper layers remained humid.  2.2. Climate Data and Soil Water Content  Air  temperatures  during  the  trial  were  recorded  by  a  weather  station  positioned  at  the  experimental location. Daily mean (Tmean), maximum (Tmax) and minimum (Tmin) air temperature were  measured and averaged for each month (Figure 2).  Figure 2. Minimum, maximum and mean air temperatures (°C) registered for the months throughout  the  experiment.  Tmax—maximum  air  temperature;  Tmin—minimum  air  temperature;  Tmean—mean  temperature.  For the soil water content (SWC) measurements, six additional 30 cm pipes were sowed with a  cowpea genotype and submitted to control and drought stress following the steps described in “2.1.  Plant material and experimental design”. The pipes’ SWC was monitored 14, 28 and 42 days after  Agronomy 2020, 10, 1604  5  of  20  drought stress imposition. For each measurement, a pipe of 30 and 90 cm was cut in two and six  sections of 15 cm, respectively, and the soil was weighed before and after drying at 100 °C for 72 h.  The SWC, on a dry mass basis, was calculated according to Muñoz‐Perea et al. [22] as follows:  Mw Ms 𝐶 % 100  Ms where Mw and Ms correspond to the mass of soil (g) before and after drying, respectively.  2.3. Data Collection  The days to germination (DG) and to first flower (DFF) were recorded for each plant. Seeds were  considered germinated when hypocotyl was visible. By the end of the experiment, all plants were  carefully removed from the pipes and the soil attached to the roots was rinsed with running water.  Root, shoot and pods were separated and dried at 80 °C for 72 h to obtain root dry weight (RDW),  shoot dry weight (SDW) and pod dry weight (PDW). Root:shoot ratio (RSR) was calculated as the  quotient between RDW and SDW. The total number pods per plant (NPP) was counted and classified  as “no grain” (pod without grains), “immature” (pods with not fully developed grains) and “mature”  (pods with fully developed grains). The grains from immature and mature pods were counted to  obtain the total number grains per plant (NGP). As all the genotypes shared the same erect growth  habit, plant height (PH) was defined as the length of the main stem in cm from ground level to the  tip of the plant [23]. The stem greenness (SG) was scored on a scale of 0 to 5, with 0 being “completely  yellow” and 5 “completely green” following Muchero et al. [14].  2.4. Data Analysis  Means and standard deviations (SD) for each of the traits were calculated based on the replicates  for each genotype and treatment (n = 3). A non‐parametric two‐way analysis of variance (Aligned  Ranks  Transformation  ANOVA)  was  performed  to  assess  the  effect  of  genotype,  water  stress  treatment  and  interaction  between  them.  For  each  genotype,  differences  between  both  water  treatments were assessed using the Mann‐Whitney test. All statistical analyses were performed using  R (version 3.6.3) and a p‐value of <0.05 was considered significant. The principal component analysis  (PCA) was performed using Past (version 4.0) [24]. For the PCA, the ratio between the mean of the  three  replicates  for  each  genotype  in  control  and  drought  treatments  was  calculated  and  then  transformed  to  Z  scores  by  subtracting  the  mean  value  measured  in  each  parameter  (obs−μ)  and  dividing the result by the respective standard deviation (σ) as follows:  𝑠 µ 𝑍 𝑒   where  obs  represents  the  observed  measurement.  The  same  software  was  used  to  elaborate  a  hierarchical clustering based on the Manhattan distances between the ratios of the measured SDW  under  drought  and  control  treatments  using  the  UPGMA  (unweighted  pair  group  method  with  arithmetic mean) method. For the heat map, the measurements were first normalized to percentage  accordingly  to  the  minimum  and  maximum  values  obtained  in  each  parameter.  All  graphical  representations were created using GraphPad Prism (version 8.0.0).  3. Results and Discussion  3.1. Soil Water Conditions  Several parameters have been described as indicators of water deficit in crop plants, including  plant‐based parameters, such as stomatal conductance and biochemical markers (e.g., proline and  anthocyanins contents), and soil‐based parameters such the SWC, which seem to be indicative of  water stress condition [15,25–27]. The differences in the SWC during the trial period are summarized  in Figure 3. Soil humidity gradually decreased in all pipes and this decrease was more evident in the  90 cm pipes (drought stress). Nonetheless, the bottom layers were always more humid than the upper  layers, indicating that a successful water content deficit between both ends of the pipes was obtained.  In the upper soil layers of the drought stress pipes, a more accentuated decrease in the water content  𝑜𝑟𝑠𝑐 𝑜𝑏 𝑆𝑊 Agronomy 2020, 10, 1604  6  of  20  could be observed comparatively to the control pipes. The same result was also achieved by Iseki et  al.  [15].  During  the  first  28  days  of  drought  treatment,  humidity  levels  in  control  pipes  were  maintained  between  27  and  89%,  in  the  0–15  cm  and  15–30  cm  soil  layers,  respectively,  while  humidity levels of these layers in drought stress pipes varied from 8 to 21%. The soil water content  levels across different depths in the 90 cm pipes show an uniform increase in humidity towards the  bottom of the pipes, which is similar to what occurs in field and was observed in a previous study of  Gebre and Earl in soybean [26]. In these measurements, it was possible to observe roots in the bottom  layers of the pipes, suggesting that plants under drought stress treatment had to develop deeper roots  in order to be able to reach more humid soil layers. A significant decrease in water content of the  deepest layers was observed at the 42nd day, as a result of ending the water supply through the  bottom of the pipes. At the end of the experiment, the SWC in the drought stress pipes in all the  depths  was very low  (<15%), while  in the  control pipes the SWC was approximately 50%. These  results indicate that the conditions used in this experiment were adequate, confirming that genotypes  in the pipes of 90 cm were effectively under drought stress conditions. Moreover, as mentioned by  Gebre and Earl [26], experiments that explore plant‐water relationships using rooting cylinder, as  opposed to small pots, allow a more realistic simulation of drought in field environments and allow  further  information  on  root  development,  namely  rooting  depth  [26].  Kashiwagi  et  al.  [27]  also  revealed that a cylinder protocol in chickpea could be a good choice for screening root traits.  Figure 3. Soil water content (SWC) in different depths (from pipes’ top to base) of control (a, from 0  to  30  cm)  and  stress  pipes  (b,  from  0  to  90  cm)  measured  in  3  different  days  after  imposition  of  drought.  3.2. Evaluation of Agro‐Morphological Parameters  For all evaluated parameters, the effect of treatment and genotype was significant (p < 0.05),  except for the treatment on DFF (Table 2). The genotype × treatment interaction was significant (p <  0.05) for the majority of the evaluated parameters except PH, RDW and DFF, indicating that the effect  of the drought treatment differed between genotypes. Apart from DFF, results showed an overall  reduction in the above‐ground parameters’ measurements (SDW, PH, SG, NPP, PDW and NGP) in  the  drought  stress  treatment  compared  to  the  control.  Contrarily,  root‐related  parameters  were  increased under drought stress conditions (Figure 4) suggesting that cowpea drought tolerance may  be related to the development of the root system.  Agronomy 2020, 10, 1604  7  of  20  Table 2. Aligned Rank Transformation ANOVA analysis of the different measured parameters in the  29 studied cowpea genotypes under control (30 cm pipes) and drought stress (90 cm pipes) at 42 days  of water stress.  Parameter    Source  DF *  Residual DF  F  Prob < F  Treatment  1  116  293.1  <0.001  SDW  Genotype  28  116  3.1  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  2.7  <0.001  Treatment  1  116  13.493  <0.001  PH  Genotype  28  116  6.6  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  1.2  0.234  Treatment  1  112  253.5  <0.001  PDW  Genotype  27  112  4.6  <0.001  Treatment: Genotype  27  112  2.6  <0.001  Treatment  1  116  130.5  <0.001  SG  Genotype  28  116  6.9  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  2.3  0.001  Treatment  1  112  151.5  <0.001  NPP  Genotype  27  112  5.3  <0.001  Treatment: Genotype  27  112  2.1  0.004  Treatment  1  112  186.8  <0.001  NGP  Genotype  27  112  5.2  <0.001  Treatment: Genotype  27  112  4.4  <0.001  Treatment  1  116  15.5  <0.001  RDW  Genotype  28  116  3.4  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  1.1  0.352  Treatment  1  116  294.6  <0.001  RSR  Genotype  28  116  3.3  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  2.7  <0.001  Treatment  1  116  0.0  0.906  DFF  Genotype  28  116  5.1  <0.001     Treatment: Genotype  28  116  1.3  0.178   SDW—shoot dry weight; PH—plant height; PDW—pod dry weight; SG—stem greenness; NPP— number of pods per plant; NGP—number of grains per plant; RDW—root dry weight; RSR—root to  shoot ratio; DFF—days to first flower. * DF—degrees of freedom.  Figure 4. Variation percentage observed in the average of all cowpea genotypes in the drought stress  condition compared to the plants under control condition, after 42 days of drought stress treatments.  Agronomy 2020, 10, 1604  8  of  20  3.2.1. Shoot‐Related Parameters  SDW,  SG  and  PH  suffered  a  reduction  of  48.46,  28.95  and  11.40%,  respectively  (Figure  4).  Differences in the average of PH were relatively small between both treatments (136.68 and 121.10  cm  in  control  and  drought  treatments,  respectively),  with  only  C18,  C29,  C41  and  IT93K‐503‐1  genotypes presenting significant reductions (p < 0.05) (Figure 5b). Contrarily, differences in mean  SDW were significant (p < 0.05) (except for C15, C43, C47 and C58) with average mean values in  control plants being twice (17.24 g) the values recorded in plants under drought treatment (8.89 g)  (Figure  5a).  These  results  indicate  that  the  plants  were  able  to  maintain  similar  heights  in  both  treatments, but their shoot biomass was largely reduced. The reduction in SDW in cowpea under  drought stress conditions was also verified in other studies [28–30], including other Vigna species  [15], with this being considered a common effect of drought stress in legumes [31]. Plants with lower  shoot  biomass  are  likely  to  have  lower  water  consumption,  which  allows  them  to  maintain  an  adequate  water  status  under  drought  conditions  [15].  SG  is  an  important  indicator  of  drought  tolerance in cowpea genotypes at a seedling stage [14], but it is not commonly evaluated in cowpea  screenings at the vegetative and reproductive stage. In other crops, such as sorghum, the ability to  maintain  stem  greenness  under  drought  conditions  at  a  post‐flowering  stage  indicates  higher  drought tolerance [32]. SG was also clearly reduced under drought stress, in which the average of SG  across genotypes was 2.97, while, in control pipes, it was 4.18. Significant differences (p < 0.05) in SG  between treatments were found in the genotypes Bambey21, C18, C19, C23, C31, C41, C47, C52, C53  C58, C59, C8 and IT93K‐503‐1 (Figure 5c). Despite the treatment effect being non‐significant (p > 0.05) for DFF (Table 2), it was observed  that genotype C59 only reached flowering stage in the control treatment but not under drought stress,  indicating that water availability may have affected its flowering time (Table S1). Similarly, not all  replicates of the genotypes C11, C15, C41 and C52 reached flowering in drought treatment. However,  it was also observed that some replicates of the genotypes C41 and C59 also did not flower under  control  conditions.  All  genotypes,  with  the  exception  of  IT93K‐503‐1,  presented  similar  DFF,  suggesting  identic  photoperiod‐sensitivity.  Since  IT93K‐503‐1  did  not  reach  flowering,  it  was  not  included in the analysis of yield‐related parameters (PDW, NGP and NPP).  For the yield‐related parameters, namely PDW, NGP and NPP, considerable reductions were  also observed under drought stress (62.19, 58.66 and 45.48%, respectively) (Figure 4). The mean NPP  and NGP found in these drought stress treated plants (3.86 and 16.91g, respectively) was significantly  lower  than  the  means  observed  in the  control  plants  (7.08 and 40.93  g,  respectively).  Due to  this  decrease, total PDW in the drought stress treatment was 2.84 g, contrasting with 7.52 g in the control.  Significant differences (p < 0.05) between genotypes C23, C3, C41, C45, C49, C51, C52 and C53 were  found  in  all  yield  related  parameters  (NPP,  NGP  and  PDW),  demonstrating  a  clear  effect  of  the  drought stress in these genotypes (Figure 6). This significant decrease in the NPP, NGP and PDW  under drought stress for the genotypes C41 and C52 is in accordance with the absence of flowering  previously mentioned. Overall, PDW significantly decreased under drought conditions, while the  decreases in NPP and NGP were not so marked, wherein statistically significant differences were  only  found in  some  genotypes.  Genotypes  C15,  C19,  C31,  C43  and  C58 did  not  show  significant  differences (p > 0.05) in any of the yield‐related parameters (p < 0.05), suggesting a lower effect of  drought treatment. In the study developed by Mendes et al. [30], cowpea accessions, when subjected  to drought stress, were less affected in their source capacity (leaf related parameters) but presented  considerable reductions in their sink size, namely in the number of pods and grains per plant. Some  studies mention that the number of pods per plant in cowpea is much affected by drought stress, thus  being an important trait in studies of drought tolerance [30,33,34]. The number of pods might be the  major contributor to the decreased cowpea grain yield under drought stress [33]. Leite et al. [35],  performed a study where a specific cowpea genotype (cv. EMAPA‐821) was subjected to drought  stress in vegetative, pre‐flowering and pod filling phases, showing that the effect of drought was  most severe during pod filling. Based on these results, the authors suggested that the development  of less pods could be a drought tolerance mechanism used by this crop to seek for better conditions.  Agronomy 2020, 10, 1604  9  of  20  Figure 5. Differences in the shoot dry weight (SDW) (a), plant height (PH) (b) and stem greenness  (SG) (c) of the evaluated genotypes after 42 days in control and drought stress conditions. The data  presented corresponds to the means ± SD (error bars). * represents significant differences between  treatments according to Mann‐Whitney U Test at p < 0.05 level.  Agronomy 2020, 10, 1604  10  of  20  Figure 6.  Differences in  the pod dry  weight  (PDW)  (a),  number  of  pods  per  plant  (NPP)  (b)  and  number of grains per plant (NGP) (c) of the evaluated genotypes after 42 days under control and  drought stress conditions. The data presented corresponds to the means ± SD (error bars). * represents  significant differences between treatments according to Mann‐Whitney U Test at p < 0.05 level.  3.2.2. Root‐Related Parameters  The root system seems to be strongly related with drought tolerance in legumes [31] and has  been highlighted for its potential applicability in drought tolerance screenings in soybean (Glycine  max L.) [36,37], chickpea (Cicer arietinum L.) [18,27,38], common bean (Phaseolus vulgaris L.) [39,40],  faba bean (Vicia faba L.) [41] and lentil (Lens culinaris ssp. culinaris Medikus) [42]. In cowpea, root traits  were suggested to have an important role in drought avoidance [12] but their use in drought tolerance  screenings is still not commonly applied, as they might involve complicated procedures using specific   require access to recently developed imaging techniques and high‐throughput  chambers that often phenotyping software that allow the visualization of the three dimensional distribution of the root in  the  soil  [16,43].  Different  legume  crops  present  distinct  responses  to  drought  regarding  root  development: common bean [39], faba bean genotypes [41] and soybean [37], show a reduced root  development, while, in chickpea genotypes [18,27,38] and in some species of the genus Vigna [15],  root growth seems to be stimulated. Moreover, Iseki et al. [15] verified that the genotypes’ tolerance  Agronomy 2020, 10, 1604  11  of  20  levels were different between terminal and non‐terminal drought treatments. Hence, the effect of  drought in the root development varies among species and the type of drought stress imposed.  To avoid interpretation errors that could be induced by the differential size of the control and  stress tubes, the root length data is not shown. Our results show that root‐related parameters varied  differently from the shoot‐related parameters. Contrarily to shoot‐related parameters, the RDW and  RSR were 24.57 and 136.98% higher, respectively, under drought stress conditions comparatively to  control  (Figure  4),  suggesting  that  droughted  plants,  overall,  prioritized  root  development  over  shoot. Accordingly, mean RDW was also higher in drought stress conditions (2.59 g) than in control  (2.08 g), although this increment was less pronounced (24.57%) and significant differences (p < 0.05)  were only observed in genotypes C11, C31, C52 and C53 (Figure 7a). The difference between mean  RSR in the two treatments was larger, varying from 0.13 to 0.31 in control and droughted plants,  respectively. All genotypes, except Bambey21, C15, C58 and C59, showed significant differences (p <  0.05) in the RSR between the two treatments (Figure 7b). Similar results were obtained by Gebre and  Earl  [26]  in  soybean,  where  RSR  increased  by  18%  under  drought  conditions.  In  other  crops,  an  increased RSR in response to drought stress was associated with more sucrose being transported  from leaves to roots [44]. In Vigna species, Iseki et al.’s [15] study showed that deeper roots alone do  not  guarantee  enough  water  absorption  to  sustain  shoot  growth.  Rather,  a  greater  root  biomass,  which  suggests  a  higher  number  of  roots,  appears  to  be  a  key  factor  to  overcome  poor  water  absorption. More tolerant genotypes seem to increase RDW when subjected to drought stress, while  susceptible genotypes decreased RDW. The increased root biomass under drought conditions might  be related to the accumulation of abscisic acid (ABA) in the roots [45]. Moreover, roots with higher  biomass values are associated with an increased hydraulic conductivity that allows better tolerance  to drought conditions [46].  Figure 7. Differences in the root dry weight (RDW) (a), and root:shoot ratio (RSR) (b) of the evaluated  genotypes after 42 days under control and drought stress conditions. The data presented corresponds  to  the  means  ±  standard  deviations  (error  bars).  *  represents  significant  differences  between  treatments according to Mann‐Whitney U Test at p < 0.05 level.  Agronomy 2020, 10, 1604  12  of  20  3.3. Principal Component Analysis  In  this  study,  we  performed  a  PCA  in  order  to  determine  the  most  contributive  agro‐ morphological traits for the distribution of this set of genotypes in the two treatments (Table 3; Figure  8)  and,  consequently,  the  traits  that  could  be  contributing  the  most  to  drought  tolerance.  PCA  distribution based on parameters of interest has been considered a useful complementary tool in  drought  tolerance  screenings  and,  consequently,  in  the  selection  of  the  most  tolerant  genotypes,  namely in drought tolerance screenings of cowpea [47] and other crops, such as common bean [48],  chickpea  [49]  and  bread  wheat  [50].  Results  showed  that  the  first  three  principal  components  presented  eigenvalues  superior  to  1,  and  together  explained  81.72%  of  the  total  variation  (PC1:  40.57%,  PC2:  21.73%  and  PC3:  19.42%)  (Table  3).  The  first  principal  component  was  primarily  associated with yield components (NPP, PDW and NGP), while the second principal component was  more  correlated  with  the  evaluated  root  characteristics  (RDW  and  RSR)  and  the  third  principal  component with SDW and PH.  Our results show that NPP, PDW and NGP were the most contributive factors for the dispersion  of the genotypes along the PC1 axis. At the seedling stage, Nkomo et al. [47] also denoted a heavy  contribution  of  pod  and  grain  related  components,  namely  PDW,  for  the  screening  of  drought  tolerant cowpea genotypes. Alidu [51] observed that the reduction in shoot biomass as the result of  drought imposition at the vegetative phase is one of the main reasons for a decreased yield. Our  results seem to corroborate this observation, since genotypes with higher SDW also present a higher  number of pods and grains per plant. In contrast, a negative correlation between average grain yield  and shoot length, root length and fresh and dry weight of the plants was found in chickpea genotypes  under drought stress [49]. Furthermore, Alidu [51] denoted a linear correlation between NPP and  grain yield, thus suggesting that the pod number can act as an indicator of potential yield.  RDW  and  RSR  were  the  main  contributing  factors  to  the  variation  along  the  PC2  axis,  establishing a positive association. In bread wheat (Triticum aestivum L.) genotypes, RSR also was  among the main contributing characteristics to the variation observed under drought conditions [50].  RDW, among other traits, was identified by Abdou Razakou et al. [52] as a reliable parameter for the  screening of drought tolerant cowpea seedlings. According to Wasaya et al. [17], root phenotyping is  as  important  as  shoot  phenotyping,  since  roots  are  the  main  responsible  organ  for  the  plant’s  performance in relation to water and nutrient absorption. The negative association of SDW, SG and,  to  some  extent,  PH  in  PC2  indicates  that  drought  stressed  genotypes  are  either  increasing  shoot  biomass at the expense of root biomass or the opposite. This result has also been observed in other  studies [15,51].  The variation observed in PC3 was predominantly and positively associated with SDW and PH.  Higher shoot height and biomass likely translates to a larger photosynthetic apparatus able to sustain  higher grain yield [51]. However, in the study of Ayala et al. [53], an inversed correlation between  shoot development (SDW and PH) and water use efficiency was observed, suggesting that greater  shoot  development  leads  to  a  higher  loss  of  water  being  prejudicial  under  drought  conditions.  Likewise, Iseki et al. [15] also found shoot biomass to be related with plant water status, where lower  shoot biomass could confer better drought tolerance.  The distribution of the genotypes based on the effects of drought stress relative to control for all  parameters suggests a wide variability of the studied genotypes. This variability was expected as the  cowpea  genotypes  had  origins  in  different  worldwide  countries.  However,  the  dispersion  of  the  genotypes in the PCA did not reflect any obvious groupings based on similar origins. This result is  in  accordance  with  a  previous  study  [19].  All  evaluated  parameters  revealed  considerable  contributions  to  the  variation  observed  between  genotypes  under  drought  treatment.  This  phenotypic  variability  under  drought  stress  might  represent  an  important  resource  for  plant  breeders.  Agronomy 2020, 10, 1604  13  of  20  Table 3. Principal component analysis (PCA) of the effect of drought treatment on morphological  parameters from 29 cowpea genotypes. Measured values under drought treatment were divided by  the respective control to obtain a ratio between both treatments.  Parameters   PC 1  PC 2  PC3  SDW  0.29 −0.26  0.51  PH −0.05 −0.01  0.67  SG −0.29 −0.23  0.37  NPP  0.49  0.05  0.06  PDW  0.54  0.10 −0.01  RDW  0.08  0.62  0.38  NGP  0.51  0.05 −0.12  RSR −0.20  0.69  0.01  Eigenvalue  3.36  1.80  1.61  % variance  40.57  21.73  19.42   SDW—shoot dry weight; PH—plant height; PDW—pod dry weight; SG—stem greenness; NPP— number of pods per plant; NGP—number of grains per plant; RDW—root dry weight; RSR—root to  shoot ratio.  Figure 8. Principal component analysis (PCA) of the effect of drought treatment in 29 genotypes.  Measured values under drought treatment were divided by the respective control to obtain a ratio  between  both  treatments  (control—white  squares;  drought—black  dots).  The  lines  indicate  eigenvectors representing the strength (given by the length of the vector) and the direction of the  parameter correlation relative to the first two principal components (PC1 and PC2). SDW—shoot dry  weight; SG—stem greenness; PH—plant height; NPP—number of pods per plant; NGP—number of  grains per plant; PDW—pods dry weight; RDW—root dry weight; RSR—root:shoot ratio.  3.4. Screening for Drought Tolerant Genotypes  A  dendrogram  was  elaborated  based  on  the  ratio  of  SDW  between  drought  treatment  and  control  for  each  genotype  (Figure  9).  Relative  SDW  translates  into  how  much  vegetative  growth  (expressed as shoot biomass) was affected by drought, and hence was used as a drought tolerance  indicator. As suggested by the PCA, drought tolerance in cowpea seems to result from a complex of  traits that can act simultaneously or singly and vary between different genotypes. The complexity  and variability of the traits related to drought tolerance has been observed in previous studies [12,54].  Hence, the use of different traits, such as the ones here presented, might provide a more complete  resource  of  phenotypic  diversity  to  drought  tolerance  breeding.  In  order  to  assess  the  resulting  Agronomy 2020, 10, 1604  14  of  20  clustering in a more integrated and holistic manner, a heat map with the ratios of SDW, PH, SG, RDW  and RSR between drought and control treatment was included (Figure 9). This made it possible to  make inferences about how the different traits combine with vegetative growth and which genotypes  present the most interesting set of characteristics that might confer drought tolerance. Since drought  was imposed at an early vegetative phase, not all plants were able to produce fully matured grains  (hence the overall low number of mature pods seen in table S2). Therefore, all parameters related to  the reproductive phase (PDW, NGP and NPP) were not used for the screening of the most drought  tolerant genotypes.  Figure 9. Analysis of morphological characteristics on 29 cowpea genotypes under drought stress (90  cm pipes) relative to control (30 cm pipes). The dendrogram shows the Manhattan distances between  genotypes based on the ratio of SDW between drought treatment and control using UPGMA method.  The  heat  map  shows  the  ratios  of  SDW,  PH,  SG,  RDW  and  RSR  between  drought  and  control  treatment obtained for each genotype, normalized to percentage, where 0 and 100% represents the  minimum and maximum values registered in each parameter. SDW—shoot dry weight; SG—stem  greenness; RDW—root dry weight; RSR—root: shoot ratio.  Agronomy 2020, 10, 1604  15  of  20  The clustering divided this set of genotypes into two main groups (I and II) that were further  subdivided  into  A,  B,  C  and  D  and  E  subgroups,  respectively.  Group  I  comprised  most  of  the  evaluated genotypes. Drought stimulated a lower reduction in shoot biomass in the genotypes from  subgroup  A (48%)  than those  observed  in  genotypes from subgroups  B (56%)  and  C (67%).  This  subgroup A includes IT93K‐503‐1, the drought tolerant reference. Despite all genotypes in subgroup  A having similar relative SDW, the same homogeneity was not observed in the other parameters.  Regarding root parameters (RDW and RSR), C5, C24, C39, C51 and C57 genotypes presented the  highest  increases  under  drought  treatment,  whilst  the  opposite  was  found  in  C21,  C23,  C29  and  IT93K‐503‐1 genotypes. SG was maintained in genotypes C5, C20, C21, C23, C29, C39, C49 and IT93K‐ 503‐1. When subjected to drought at the seedling stage, IT93K‐503‐1 also maintained SG, and this  phenotype was related to higher drought tolerance [14]. Similarly, maintenance of SG under drought  conditions is also an indicator of delayed senescence, and thus, drought tolerance [54]. Despite being  considered drought tolerant, the IT93K‐503‐1 genotype still suffered a reduction in shoot biomass.  This could be explained as a response to drought, where shoot metabolism is deactivated to lower  the  uptake  of  nutrients  and  water  [55].  Genotypes  in  subgroup  B  (composed  by  Bambey21,  the  drought  susceptible  reference  genotype  and  C8,  C18,  C22,  C41,  C45  and  C53  genotypes)  and  subgroup  C  (C3  and  C52  genotypes)  presented  the  highest  reductions  in  SDW  under  drought  treatment, thus being considered the most susceptible to drought. Despite being the most affected by  drought  treatment  in  terms  of  shoot  biomass,  genotypes  C52  and  C3  were  able  to  maintain  SG,  suggesting that shoot biomass reduction might have allowed maintenance of a more adequate plant  water status. Overall, genotypes from subgroup B and C were characterized by low scores in all  evaluated parameters, with some exceptions. C45, C52 and C53 presented superior values of relative  RDW and RSR and were able to maintain their stem greenness under drought conditions. Contrarily,  Bambey21 clearly differentiates from the rest of genotypes in subgroups B and C by the affected root  development  in  terms  of  RDW  and  RSR.  The  Bambey21  genotype  has  been  demonstrated  to  be  susceptible to drought stress in previous works [14,25,56,57]. Contrarily to most of the remaining  genotypes, in which drought promoted the allocation of biomass to root, the RDW of Bambey21 was  slightly  decreased.  Nonetheless,  this  decrease  was  non‐significant  (p  >  0.05).  RSR  was  slightly  increased under drought stress, probably due to a more intense reduction in shoot biomass. The role  of root development in drought tolerance, among other factors, might explain the susceptibility of  this genotype. Similar to our results, in the study of Ogbonnaya et al. [57], Bambey21 presented lower  root biomass and RSR than the other tested genotypes. In light of these results, we hypothesized that  low RDW and RSR could be related to the increased susceptibility of cowpea. Finally, subgroup C  consists of the two genotypes (C3 and C52) with the lowest relative SDW, indicating that vegetative  growth was severely affected by drought treatment.  Group II comprises the genotypes with the highest relative SDW, suggesting that these were the  least  affected  by  drought  in  the  vegetative  growth.  Interestingly,  under  control  conditions,  the  genotypes in subgroup D (C11, C31, C47, C56, and C59) and E (C15, C43 and C58) presented the  lowest  SDW  among  all  genotypes.  These  genotypes  were  also  the  ones  that  suffered  the  least  reduction under drought treatment (SDW reduction percentages in subgroups D and E were 37 and  22%, respectively). Previous studies have showed that genotypes with smaller shoot biomass achieve  better water status and thus are more able to tolerate drought [15,52]. Even though a higher shoot  biomass could lead to detrimental water losses through transpiration under drought conditions [15],  an increase in net photosynthesis, as a consequence of a higher number of leaves, might support a  higher accumulation of dry matter in pods, thus promoting a better yield [31,51]. Although genotypes  in subgroup E maintained a higher shoot biomass compared to subgroup D, the genotypes in the last‐ mentioned  subgroup  presented  a  better  performance  in  the  rest  of  the  evaluated  parameters,  particularly regarding RDW. The importance of root traits to drought tolerance in cowpea has been  suggested in previous works [12], wherein root biomass seems to play an important role in a greater  water absorption capacity [15]. One of the mechanisms of drought tolerance in common bean seems  to involve a higher secondary lateral root development [39], which possibly translates into higher  root biomass. Our results show that genotypes that were able to develop higher root biomass under  Agronomy 2020, 10, 1604  16  of  20  drought treatment (particularly genotypes in subgroup D) were able to sustain shoot development  with  smaller  reductions  in  SDW,  PH  and  SG  relatively  to  control  conditions.  In  light  of  these  observations, increasing root biomass might confer higher drought tolerance. Therefore, subgroup D  seems to group the genotypes better adapted to drought regarding both root and shoot development,  with the exception of C31 and C59, which presented considerable reductions in shoot (PH and SG)  and root traits (RDW and RSR), respectively. Our results made it possible to corroborate a previous  study where C11 and C47 genotypes were classified as drought tolerant at the germination level [13].  The indication that some of these genotypes are also drought tolerant at the germination level further  reveals their importance for future breeding programs. As a final remark, reductions in NPP, NGP  and PDW varied greatly among the evaluated genotypes. In group II, the subgroup E, particularly  C43  and  C58,  was  less  affected  than  genotypes  in  subgroup  D  in  the  NPP,  NGP  and  PDW.  The  genotypes  C31,  C43,  C56  and  C58  suffered  reductions  inferior  to  50%  in  NPP,  NGP  and  PDW,  indicating that these genotypes might be able to provide better yield under drought conditions than  the remaining genotypes in group II. Contrarily, genotypes C15 and C59 were severely affected, with  little to no production of pods under drought treatment. However, as previously mentioned, further  studies that focus on yield are required and the data here presented should be only interpreted as  indicators of potential yield under drought stress.  4. Conclusions  Cowpea is known for its drought tolerance and thus is considered an important legume crop to  face the future constrains due to climate change. Our results show that when subjected to an intense  drought stress, cowpea seems to prioritize root development over shoot, which reflected the overall  significant  reduction  in  SDW,  SG,  PDW,  NPP  and  NGP,  whereas  RDW  and  RSR  significantly  increased.  PCA  depicted  that  all  evaluated  parameters  had  considerable  contributions  for  the  variation observed between both water treatments among genotypes, indicating that besides above‐ ground  characteristics,  root‐related  parameters  are  also  important  factors  for  drought  tolerance  screenings in cowpea. The hierarchical clustering of the genotypes under drought stress based on  vegetative growth retardation (differences in shoot biomass between control and drought conditions)  revealed that the majority of the genotypes with the least reductions in shoot biomass under drought  conditions also presented the highest increases in root biomass, suggesting the importance of this  trait  to  drought  tolerance.  In light  of these  results, a  set  of  genotypes  with  the  lowest  vegetative  growth retardation was identified, namely C11, C15, C31, C43, C47, C56, C58 and C59. From this  group, the most drought tolerant genotypes were C11, C47 and C56 since these showed generally  higher drought/control ratios in all measured parameters. It is important to mention that, being the  result of several mechanisms, drought tolerance variations cannot be explained only by a simple  tolerance  factor.  In  further  cowpea  experiments  using  pipes  methodologies  exploring  root  morphology and its role in drought tolerance, it would be advantageous the use of pipes of equal  height and to complement plants’ agro‐morphological performance with physiological, biochemical  and other developmental responses.  Supplementary Materials: The following are available online at www.mdpi.com/2073‐4395/10/10/1604/s1, Table  S1: Days to germination and flowering expressed as means ± standard deviations of the replicates (n = 3) for each  genotype and Table S2: Percentage of immature (I), mature (M) and no grain (N) pods for each genotype under  control and drought conditions.  Author Contributions: Conceptualization, V.C. and I.C.; methodology, R.S., M.C., V.C. and I.C.; formal analysis,  R.S. and M.C.; investigation, R.S. and M.C.; resources, V.C. and I.C.; data curation, R.S., M.C., V.C. and I.C.;  writing—original draft preparation, R.S.; writing—review and editing, M.C., E.R., V.C., I.C.; supervision, M.C.,  V.C. and I.C.; project administration, V.C. and I.C.; funding acquisition, V.C. and I.C. All authors have read and  agreed to the published version of the manuscript.  Funding:  This  research  was  funded  by  National  Funds  by  FCT—Portuguese  Foundation  for  Science  and  Technology, under the project grant number UIDB/04033/2020.  Agronomy 2020, 10, 1604  17  of  20  Acknowledgments:  The  authors  would  like  to  thank  the  Agricultural  University  of  Athens  (AUA,  Greece),  Botanic  Garden  Meise  (BGM,  Belgium),  National  Plant  Genetic  Resources  Centre‐National  Institute  for  Agricultural and Food Technology Research (CRF‐INIA, Spain), Instituto Nacional de Investigação Agrária e  Veterinária—Elvas (INIAV‐Elvas, Portugal), Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK,  Germany) and University of California Riverside (UCR, USA) for providing seeds, and Professor Raúl Morais  for providing climate data.  Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.  References  1. Huang, S.; Li, P.; Huang, Q.; Leng, G.; Hou, B.; Ma, L. The propagation from meteorological to hydrological  drought and its potential influence factors. J. Hydrol. 2017, 547, 184–195, doi:10.1016/j.jhydrol.2017.01.041.  2. Leng, G.; Hall, J. Crop yield sensitivity of global major agricultural countries to droughts and the projected  changes in the future. Sci. Total Environ. 2019, 654, 811–821, doi:10.1016/j.scitotenv.2018.10.434.  3. Singh,  R.;  Singh,  H.;  Raghubanshi,  A.S.  Challenges  and  opportunities  for  agricultural  sustainability  in  changing  climate  scenarios:  A  perspective  on  Indian  agriculture.  Trop.  Ecol.  2019,  60,  167–185,  doi:10.1007/s42965‐019‐00029‐w.  4. FAOSTAT Food and Agriculture Organization of the United Nations—Statistics Division. Available online:  http://faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E (accessed on 18 February 2020).  5. Watson, C.A.; Reckling, M.; Preissel, S.; Bachinger, J.; Bergkvist, G.; Kuhlman, T.; Lindström, K.; Nemecek,  T.; Topp, C.F.; Vanhatalo, A.; et al. Grain Legume Production and Use in European Agricultural Systems.  In Advances in Agronomy; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2017; Volume 144, pp. 235–303.  6. Gonçalves, A.; Goufo, P.; Barros, A.; Domínguez‐Perles, R.; Trindade, H.; Rosa, E.A.; Ferreira, L.; Rodrigues,  M. Cowpea (Vigna unguiculata L. Walp), a renewed multipurpose crop for a more sustainable agri‐food  system: Nutritional advantages and constraints. J. Sci. Food Agric. 2016, 96, 2941–2951, doi:10.1002/jsfa.7644.  7. Ofuya, Z.; Akhidue, V. The role of pulses in human nutrition: A review. J. Appl. Sci. Environ. Manag. 2006,  9, 99–104, doi:10.4314/jasem.v9i3.17361.  8. Carsky, R.J.; Vanlauwe, B.; Lyasse, O. Cowpea rotation as a resource management technology for cereal‐ based  systems  in  the  savannas  of  West  Africa.  In  Challenges  and  Opportunities  for  Enhancing  Sustainable  Cowpea Production; Fatokun, C.A., Tarawali, S.A., Singh, B.B., Kormawa, P.M., Tamò, M., Eds.; International  Institute of Tropical Agriculture: Ibadan, Nigeria, 2002; pp. 251–266.  9. Hall,  A.E.  Breeding  for  adaptation  to  drought  and  heat  in  cowpea.  Eur.  J.  Agron.  2004,  21,  447–454,  doi:10.1016/j.eja.2004.07.005.  10. Carvalho, M.; Lino‐Neto, T.; Rosa, E.; Carnide, V. Cowpea: A legume crop for a challenging environment.  J. Sci. Food Agric. 2017, 97, 4273–4284, doi:10.1002/jsfa.8250.  11. Herniter, I.; Muñoz‐Amatriaín, M.; Close, T. Genetic, textual, and archaeological evidence of the historical  global spread of cowpea (Vigna unguiculata [L.] Walp). Legume Sci. 2020, e57, doi:10.1002/leg3.57  12. Agbicodo, E.M.; Fatokun, C.A.; Muranaka, S.; Visser, R.G.F.; Van Der, C.G.L. Breeding drought tolerant  cowpea:  Constraints,  accomplishments,  and  future  prospects.  Euphytica  2009,  167,  353–370,  doi:10.1007/s10681‐009‐9893‐8.  13. Carvalho,  M.;  Matos,  M.;  Castro,  I.;  Monteiro,  E.;  Rosa,  E.;  Lino‐Neto,  T.;  Carnide,  V.  Screening  of  worldwide cowpea collection to drought tolerant at a germination stage. Sci. Hortic. 2019, 247, 107–115,  doi:10.1016/j.scienta.2018.11.082.  14. Muchero,  W.;  Ehlers,  J.D.;  A  Roberts,  P.  Seedling  Stage  Drought‐Induced  Phenotypes  and  Drought‐ Responsive  Genes  in  Diverse  Cowpea  Genotypes.  Crop.  Sci.  2008,  48,  541–552,  doi:10.2135/cropsci2007.07.0397.  15. Iseki, K.; Takahashi, Y.; Muto, C.; Naito, K.; Tomooka, N. Diversity of Drought Tolerance in the Genus  Vigna. Front. Plant Sci. 2018, 9, 1–18, doi:10.3389/fpls.2018.00729.  16. Matsui, T.; Singh, B.B. Root Characteristics in Cowpea Related to Drought Tolerance at the Seedling Stage.  Exp. Agric. 2003, 39, 29–38, doi:10.1017/s0014479703001108.  17. Wasaya, A.; Zhang, X.; Fang, Q.; Yan, Z. Root Phenotyping for Drought Tolerance: A Review. Agronomy  2018, 8, 241, doi:10.3390/agronomy8110241.  Agronomy 2020, 10, 1604  18  of  20  18. Ramamoorthy, P.; Lakshmanan, K.; Upadhyaya, H.D.; Vadez, V.; Varshney, R.K. Root traits confer grain  yield advantages under terminal drought in chickpea (Cicer arietinum L.). Field Crop. Res. 2017, 201, 146–161,  doi:10.1016/j.fcr.2016.11.004.  19. Carvalho, M.; Bebeli, P.J.; Pereira, G.; Castro, I.; Egea‐Gilabert, C.; Matos, M.; Lazaridi, E.; Duarte, I.; Lino‐ Neto, T.; Ntatsi, G.; et al. European cowpea landraces for a more sustainable agriculture system and novel  foods. J. Sci. Food Agric. 2017, 97, 4399–4407, doi:10.1002/jsfa.8378.  20. Carvalho,  M.; Castro,  I.;  Matos,  M.;  Lino‐Neto,  T.;  Silva, V.;  Rosa, E.;  Carnide,  V.  Caracterização  agro‐ morfológica  de  acessos  de  feijão‐frade  (Vigna  unguiculata):  Bases  para  o  melhoramento.  Rev.  Ciências  Agrárias 2016, 39, 506–517, doi:10.19084/RCA16091.  21. Martos‐Fuentes, M.; Cellini, A.; Ochoa, J.; Carvalho, M.; Carnide, V.; Rosa, E.; Pereira, G.; Barcelos, C.;  Bebeli, P.J.; Egea‐Gilabert, C. Genotype by environment interactions in cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.)  grown in the Iberian Peninsula. Crop. Pasture Sci. 2017, 68, 924–931, doi:10.1071/cp17071.  22. Muñoz‐Perea, C.G.; Allen, R.G.; Westermann, D.T.; Wright, J.L.; Singh, S.P. Water use efficiency among dry  bean landraces and cultivars in drought‐stressed and non‐stressed environments. Euphytica 2007, 155, 393– 402, doi:10.1007/s10681‐006‐9340‐z.  23. Mfeka, N.; Mulidzi, A.; Lewu, F.B. Growth and yield parameters of three cowpea (Vigna unguiculata L.  Walp)  lines  as  affected  by  planting  date  and  zinc  application  rate.  South  Afr.  J.  Sci.  2018,  115,  1–8,  doi:10.17159/sajs.2019/4474.  24. Hammer, Ø.; Harper, D.A.T.; Ryan, P.D. PAS: Paleontological Statistics Software Package for Education  and Data Analysis. Palaentologia Electron. 2001, 4, 1–9.  25. Carvalho, M.; Castro, I.; Moutinho‐Pereira, J.; Correia, C.; Egea‐Cortines, M.; Matos, M.; Rosa, E.A.; Carnide,  V.; Lino‐Neto, T. Evaluating stress responses in cowpea under drought stress. J. Plant Physiol. 2019, 241,  153001, doi:10.1016/j.jplph.2019.153001.  26. Gebre, M.G.; Earl, H.J. Effects of Growth Medium and Water Stress on Soybean [Glycine max (L.) Merr.]  Growth, Soil Water Extraction and Rooting Profiles by Depth in 1‐m Rooting Columns. Front. Plant Sci.  2020, 11, 11, doi:10.3389/fpls.2020.00487.  27. Kashiwagi,  J.;  Krishnamurthy,  L.;  Crouch,  J.;  Serraj,  R.  Variability  of  root  length  density  and  its  contributions to seed yield in chickpea (Cicer arietinum L.) under terminal drought stress. Field Crop. Res.  2006, 95, 171–181, doi:10.1016/j.fcr.2005.02.012.  28. Zegaoui, Z.; Planchais, S.; Cabassa, C.; Djebbar, R.; Belbachir, O.A.; Carol, P. Variation in relative water  content, proline accumulation and stress gene expression in two cowpea landraces under drought. J. Plant  Physiol. 2017, 218, 26–34, doi:10.1016/j.jplph.2017.07.009.  29. Agele, S.O.; Ofuya, T.I.; James, P.O. Effects of watering regimes on aphid infestation and performance of  selected varieties of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) in a humid rainforest zone of Nigeria. Crop. Prot.  2006, 25, 73–78, doi:10.1016/j.cropro.2005.03.005.  30. Mendes, R.M.S.; Távora, J.A.; José, F.; Pitombeira, J.B.; Nogueira, J.M. Source‐sink relationships in cowpea  under drought stress. Rev. Ciência Agronômica 2007, 38, 95–103.Nadeem, M.; Li, J.; Yahya, M.; Sher, A.; Ma,  C.; Wang, X.; Qiu, L. Research Progress and Perspective on Drought Stress in Legumes: A Review. Int. J.  Mol. Sci. 2019, 20, 2541, doi:10.3390/ijms20102541.  31. Xu, W.; Subudhi, P.K.; Crasta, O.R.; Rosenow, D.T.; E Mullet, J.; Nguyen, H.T. Molecular mapping of QTLs  conferring  stay‐green  in  grain  sorghum  (Sorghum  bicolor  L.  Moench).  Genome  2000,  43,  461–469,  doi:10.1139/g00‐003.  32. Bastos,  E.A.;  do  Nascimento,  S.P.;  da  Silva,  E.M.;  Filho,  F.R.F.;  Gomide,  R.L.  Identification  of  cowpea  genotypes  for  drought  tolerance.  Rev.  Cienc.  Agron.  2011,  42,  100–107,  doi:10.1590/S1806‐ 66902011000100013..  33. Nascimento, J.T.; Pedrosa, M.B.; Sobrinho, J.T. Efeito da variação de níveis de água disponível no solo sobre  o  crescimento  e  produção  de  feijão  caupi,  vagens  e  grãos  verdes.  Hortic.  Bras.  2004,  22,  174–177,  doi:10.1590/s0102‐05362004000200002.  34. Leite, M.D.L.; Rodrigues, J.D.; Virgens Filho, J.S. Das Efeitos do déficit hídrico sobre a sultura do caupi, cv‐ EMAPA‐821. III‐Produção. Rev. Agric. 2000, 75, 9–20, doi:10.37856/bja.v75i1.1270.  35. Prince, S.J.; Murphy, M.; Mutava, R.N.; Zhang, Z.; Nguyen, N.; Kim, Y.H.; Pathan, S.M.; Shannon, G.J.;  Valliyodan, B.; Nguyen, H.T. Evaluation of high yielding soybean germplasm under water limitation. J.  Integr. Plant Biol. 2016, 58, 475–491, doi:10.1111/jipb.12378.  Agronomy 2020, 10, 1604  19  of  20  36. Gao, X.‐B.; Guo, C.; Li, F.; Li, M.; He, J. High Soybean Yield and Drought Adaptation Being Associated with  Canopy  Architecture,  Water  Uptake,  and  Root  Traits.  Agronomy  2020,  10,  608,  doi:10.3390/agronomy10040608.  37. Kashiwagi, J.; Krishnamurthy, L.; Upadhyaya, H.D.; Krishna, H.; Chandra, S.; Vadez, V.; Serraj, R. Genetic  variability  of  drought‐avoidance  root  traits  in  the  mini‐core  germplasm  collection  of  chickpea  (Cicer  arietinum L.). Euphytica 2005, 146, 213–222, doi:10.1007/s10681‐005‐9007‐1.  38. Polania, J.; Rao, I.M.; Cajiao, C.; Grajales, M.; Rivera, M.; Velasquez, F.; Raatz, B.; Beebe, S.E. Shoot and Root  Traits Contribute to Drought Resistance in Recombinant Inbred Lines of MD 23–24 × SEA 5 of Common  Bean. Front. Plant Sci. 2017, 8, 296, doi:10.3389/fpls.2017.00296.  39. Sponchiado, B.N.; White, J.W.; Castillo, J.A.; Jones, P.G. Root Growth of Four Common Bean Cultivars in  Relation to Drought Tolerance in Environments with Contrasting Soil Types. Exp. Agric. 1989, 25, 249–257,  doi:10.1017/s0014479700016756.  40. Belachew, K.Y.; Nagel, K.A.; Fiorani, F.; Stoddard, F.L. Diversity in root growth responses to moisture  deficit in young faba bean (Vicia faba L.) plants. PeerJ 2018, 6, e4401, doi:10.7717/peerj.4401.  41. Kumar,  J.;  Basu,  P.S.;  Srivastava,  E.;  Chaturvedi,  S.K.;  Nadarajan,  N.;  Kumar,  S.  Phenotyping  of  traits  imparting drought tolerance in lentil. Crop. Pasture Sci. 2012, 63, 547–554, doi:10.1071/cp12168.  42. Kochian, L.V. Root architecture. J. Integr. Plant Biol. 2016, 58, 190–192, doi:10.1111/jipb.12471.  43. Xu, W.; Cui, K.; Xu, A.; Nie, L.; Huang, J.; Peng, S. Drought stress condition increases root to shoot ratio via  alteration of carbohydrate partitioning and enzymatic activity in rice seedlings. Acta Physiol. Plant. 2015, 37,  9, doi:10.1007/s11738‐014‐1760‐0.  44. Blum, A. Crop responses to drought and the interpretation of adaptation. Plant Growth Regul. 1996, 20, 135– 148, doi:10.1007/bf00024010.  45. Maseda, P.H.; Fernández, R.J. Stay wet or else: Three ways in which plants can adjust hydraulically to their  environment. J. Exp. Bot. 2006, 57, 3963–3977, doi:10.1093/jxb/erl127.  46. Nkomo, G.V.; Sedibe, M.M.; Mofokeng, M.A. Phenotyping cowpea accessions at the seedling stage for  drought tolerance using the pot method. bioRxiv 2020, doi:10.1101/2020.07.10.196915.  47. Sánchez‐Reinoso,  A.D.;  Ligarreto‐Moreno,  G.A.;  Restrepo‐Díaz,  H.  Evaluation  of  drought  indices  to  identify tolerant genotypes in common bean bush (Phaseolus vulgaris L.). J. Integr. Agric. 2020, 19, 99–107,  doi:10.1016/s2095‐3119(19)62620‐1.  48. Shah, T.M.; Imran, M.; Atta, B.M.; Ashraf, M.Y.; Hameed, A.; Waqar, I.; Shafiq, M.; Hussain, K.; Naveed,  M.; Aslam, M.; et al. Selection and screening of drought tolerant high yielding chickpea genotypes based  on  physio‐biochemical  indices  and  multi‐environmental  yield  trials.  BMC  Plant  Biol.  2020,  20,  1–16,  doi:10.1186/s12870‐020‐02381‐9.  49. Arifuzzaman,  M.;  Barman,  S.;  Hayder,  S.;  Azad,  M.A.K.;  Turin,  M.T.S.;  Amzad,  M.A.;  Masuda,  M.S.  Screening  of  bread  wheat  (Triticum  aestivum  L.)  genotypes  under  drought  stress  conditions  using  multivariate analysis. Cereal Res. Commun. 2020, 48, 301–308, doi:10.1007/s42976‐020‐00039‐8.  50. Alidu, M.S. Evaluation of Cowpea Genotypes for Drought Tolerance Using the Pot Screening Approach.  Asian Res. J. Agric. 2018, 10, 1–11, doi:10.9734/arja/2018/45806.  51. Abdou,  R.I.B.Y;  Mensah,  B.;  Addam,  K.S.;  Akromah,  R.  Using  morpho‐physiological  parameters  to  evaluate cowpea varieties for drought tolerance. Int. J. Agric. Sci. Res. 2013, 2, 153–162.  52. Ayala, C.C.; Villadiego, C.C.; Pacheco, C.P.; Tatis, H.A.; Camacho, M.M.E. Growth, biomass distribution,  gas  exchange  and  chlorophyll  fluorescence  in  cowpea  (Vigna  unguiculata  (L.)  Walp.)  under  drought  conditions. Aust. J. Crop. Sci. 2020, 14, 371–381, doi:10.21475/ajcs.20.14.02.p2557.  53. Ravelombola,  W.;  Shi,  A.;  Qin,  J.;  Weng,  Y.;  Bhattarai,  G.;  Zia,  B.;  Zhou,  W.;  Mou,  B.  Investigation  on  Various Aboveground  Traits to  Identify  Drought Tolerance in Cowpea Seedlings.  HortScience 2018,  53,  1757–1765, doi:10.21273/hortsci13278‐18.  54. Gargallo‐Garriga, A.; Sardans, J.; Pérez‐Trujillo, M.; Rivas‐Ubach, A.; Oravec, M.; Vecerova, K.; Urban, O.;  Jentsch,  A.;  Kreyling,  J.;  Beierkuhnlein,  C.;  et  al.  Opposite  metabolic  responses  of  shoots  and  roots  to  drought. Sci. Rep. 2014, 4, 6829, doi:10.1038/srep06829.     Agronomy 2020, 10, 1604  20  of  20  55. Hamidou, F.; Zombré, G.; Braconnier, S. Physiological and Biochemical Responses of Cowpea Genotypes  to  Water  Stress  Under  Glasshouse  and  Field  Conditions.  J.  Agron.  Crop.  Sci.  2007,  193,  229–237,  doi:10.1111/j.1439‐037x.2007.00253.x.  56. Ogbonnaya,  C.I.;  Sarr,  B.;  Brou,  C.;  Diouf,  O.;  Diop,  N.N.;  Roy‐Macauley,  H.  Selection  of  Cowpea  Genotypes  in  Hydroponics,  Pots,  and  Field  for  Drought  Tolerance.  Crop.  Sci.  2003,  43,  1114–1120,  doi:10.2135/cropsci2003.1114.  Publisherʹs Note: MDPI stays neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional  affiliations.  © 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access  article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution  (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).  http://www.deepdyve.com/assets/images/DeepDyve-Logo-lg.png Agronomy Multidisciplinary Digital Publishing Institute

Root and Agro-Morphological Traits Performance in Cowpea under Drought Stress

Loading next page...
 
/lp/multidisciplinary-digital-publishing-institute/root-and-agro-morphological-traits-performance-in-cowpea-under-drought-buu3AmbvD8

References (58)

Publisher
Multidisciplinary Digital Publishing Institute
Copyright
© 1996-2020 MDPI (Basel, Switzerland) unless otherwise stated Disclaimer The statements, opinions and data contained in the journals are solely those of the individual authors and contributors and not of the publisher and the editor(s). MDPI stays neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations. Terms and Conditions Privacy Policy
ISSN
2073-4395
DOI
10.3390/agronomy10101604
Publisher site
See Article on Publisher Site

Abstract

Article  Root and Agro‐Morphological Traits Performance in  Cowpea under Drought Stress  1,† 2, ,† 1,2 2,3 Ricardo Santos  , Márcia Carvalho  * , Eduardo Rosa  , Valdemar Carnide     2,3 and Isaura Castro      Department of Agronomy, University of Trás‐os‐Montes and Alto Douro (UTAD), 5000‐801 Vila Real, Portugal;  santos.ricj@gmail.com (R.S.); erosa@utad.pt (E.R.)    Centre for Research and Technology of Agro‐Environment and Biological Sciences (CITAB),   University of Trás‐os‐Montes and Alto Douro (UTAD), 5000‐801 Vila Real, Portugal;   vcarnide@utad.pt (V.C.); icastro@utad.pt (I.C.)    Department of Genetics and Biotechnology, University of Trás‐os‐Montes and Alto Douro (UTAD),   5000‐801 Vila Real, Portugal  *  Correspondence: marciac@utad.pt  †  Co‐first authors (R.S. and M.C.).  Received: 17 September 2020; Accepted: 15 October 2020; Published: 20 October 2020  Abstract: Drought is responsible for major yield losses in many worldwide crops and is expected to  occur more frequently due to climate change. Cowpea, one of the most drought tolerant legumes,  stands as a promising crop in the future climatic context. The screening for genotypes well adapted  to this constraint is an  essential step  to  improve  cowpea  production.  A  collection  of 29  cowpea  genotypes  (Vigna  unguiculata  L.  Walp.)  from  the  Iberian  Peninsula  and  11  other  countries  from  worldwide regions was grown and submitted to drought stress using pipes with 30 cm (control)  and 90 cm (stress) of height in which water was supplied through the bottom. A set of root and agro‐ morphological parameters were evaluated, including shoot and root dry weight, root:shoot ratio  and stem greenness. Overall, results show that under drought stress, plants seem to invest in root  development and reduce shoot biomass. Higher root dry weight under drought conditions could  be related to a higher drought tolerance in cowpea. Based on the evaluated traits, it was possible to  identify  genotypes,  particularly  C47  (Iran),  C56  and  C11  (Portugal),  which  might  represent  promising cowpea genetic resources for improved drought tolerance breeding.  Keywords:  Vigna  unguiculata  L.  Walp;  drought  stress  tolerance;  legumes  diversity;  genetic  resources; landraces; phenotypic descriptors; water scarcity; Southern European agriculture  1. Introduction  Climate change predictions point towards an increase in extreme events in the coming years,  namely long periods of drought [1]. Drought causes yield losses in major agricultural crops [2]. Since  the global population is expected to reach over 9 billion people by 2050, agricultural systems are  required to be more productive and to assure sustainable food production under the expected climate  challenges [3].  Cowpea is an important crop in semi‐arid tropics, particularly in Africa, the continent that is  responsible for 96.4% of worldwide production [4]. Nowadays, Europe is facing a deficit of about  70%  of  grain  legumes (including  cowpea), leading a  negative trade  scenario.  For this  reason, the  increasing  of  cowpea  production  in  Europe  is  fundamental  [5].  The  dry  and  immature  seeds,  immature  pods  and  leaves  of  cowpea  plants  can  be  consumed,  providing  a  balanced  source  of  nutrients with numerous health benefits [6]. The dry grain has high protein levels (20.0–39.4%) and  Agronomy 2020, 10, 1604; doi:10.3390/agronomy10101604  www.mdpi.com/journal/agronomy  Agronomy 2020, 10, 1604  2  of  20  low fat content (3.1–30.4%) [6,7]. As with other legumes, cowpea establishes effective symbiosis with  mycorrhizae, allowing the fixation of atmospheric nitrogen. Hence, it is presented as a key rotating  crop in farming systems with infertile soils [8]. Furthermore, cowpea is one of the most drought and  high temperature tolerant legume crops [9,10] producing high yields under terminal drought stress  conditions and requiring less water than other cultivated legume species [11]. All these characteristics  emphasize cowpea as a good opportunity to increase the sustainability of agricultural systems and  counteract climate changes. Screening genotypes that are more tolerant to drought is an important  step to improve the production of this crop under the expected future climatic constraints. The ways  by which plants cope with drought stress are displayed as a complex expression of mechanisms and  factors, thereby the screening for  drought tolerant genotypes is still a difficult task [12].  A set of  different drought tolerance parameters has been used to perform screenings in cowpea genotypes  [13–16].  Shoot  biomass  variations  under  different  drought  conditions  show  correlation  with  the  plants’ water status, in which small shoot biomass leads to less water consumption, conferring higher  drought tolerance [15].  Root traits of different crops have been suggested as an important feature related with drought  tolerance [17]. Deep root systems are important for the uptake of water from deeper soil layers in  drought  conditions  [16].  Plants  may  increase  root  length  through  different  processes  such  as  increased biomass allocation and/or promoting primary root development while suppressing lateral  root growth [17]. Some reports suggested that an increase in root mass may indicate a higher plant  capability to maintain their water status [17,18]. However, these mechanisms can reduce the plants’  yield potential [12], with it being important to also include production related traits when screening  for tolerant genotypes. The evaluation of drought tolerance mechanisms using root traits is hampered  by the complexity of the methodology involved [15].  In the present study, we evaluated the performance of 29 cowpea genotypes under drought  conditions  where  different  shoot  and  root  related  agronomic  parameters  were  evaluated.  The  objectives of this work were the selection of drought tolerant genotypes that might be particularly  important  in  the  climate  change  scenario  for  Southern  Europe  and  to  further  understand  the  relevance of root related parameters in drought tolerance screenings. These results will hopefully  contribute  to  obtaining  cowpea  genotypes  with  greater  drought  tolerance,  allowing  increased  cowpea production in Europe.  2. Materials and Methods  2.1. Plant Material and Experimental Design  A total of 29 cowpea genotypes were selected based on previous research [13,19], including one  drought susceptible and one drought tolerant genotype, Bambey21 and IT93K‐503–1, respectively.  The  genotypes  were  originated  from  worldwide  countries  with  a  particular  focus  on  Iberian  Peninsula genotypes (8 from Portugal and 8 from Spain) (Table 1). All the genotypes were previously  tested in field experiments, revealing that they have an erect growth habit [19–21].  This  study  followed  the  experimental  design  proposed  by  Iseki  et  al.  [15]  with  some  modifications. The experiment took place under open field conditions at the Universidade de Trás‐ os‐Montes e Alto Douro (41°17′10″ N 7°44′8″ E) and was divided into two stages: (a) all plants were  grown in 30 cm pipes; (b) the pipe height of half of the replicates was increased to 90 cm, to simulate  drought conditions (Figure 1). Pipes were protected by a small wire structure that allowed the sliding  of a retractable cover that was only used when it was raining, being removed as soon as it stopped.  Agronomy 2020, 10, 1604  3  of  20  Table 1. List of the cowpea genotypes used in this study including their origin and type.        #  Code Bank Code Origin Donor Institution  Type            C3 Cp 4924 Évora, Portugal INIAV Landrace           C5 Cp 5648 Abrantes, Portugal INIAV Landrace           C8 Vg 50 Pinhel, Portugal UTAD Landrace Macedo de Cavaleiros,          C11 Vg 56 UTAD Landrace Portugal           C15 Fradel Portugal INIAV Variety           C56 Vg 59 Fundão, Portugal UTAD Landrace           C57 Vg 62 Covilhã, Portugal UTAD Landrace           C58 Vg 72 Mogadouro, Portugal UTAD Landrace           C18 BGE038478 Málaga, Spain CRF‐INIA Landrace Breeding          C59 IT97K‐499‐35 Nigeria UCR line           C41 VIG 58 Angola IPK Landrace           C43 VIG 90 Egypt IPK Landrace           C45 VIG 49 Senegal IPK Landrace           C47 VIG 1649 Iran IPK Landrace           C49 VIG 206 Cuba IPK Landrace           C51 VIG 10 China IPK Landrace           C52 NI 778 India BGM Landrace Baio          C53 Brazil EMBRAPA Variety Cooafom           C19 BGE002195 Orense, Spain CRF‐INIA Landrace           C20 BGE019751 Girona, Spain CRF‐INIA Landrace           C21 BGE024703 Baleares, Spain CRF‐INIA Landrace           C22 BGE025213 Caceres, Spain CRF‐INIA Landrace           C23 BGE047731 Pontevedra, Spain CRF‐INIA Landrace           C24 BGE036461 Huelva, Spain CRF‐INIA Landrace           C29 BGE039237 Cordoba, Spain CRF‐INIA Landrace           C31 MG 113779 Puglia, Italy CRF‐INIA Landrace           C39 AUA 1 Crete, Greece AUA Landrace          References IT93K‐ Breeding        IT93K‐503‐1 Nigeria UCR     503‐1 line           Bambey21 Bambey21 Senegal UCR Cultivar   AUA—Agricultural  University  of  Athens,  Greece;  BGM—Botanic  Garden  Meise,  Belgium;  CRF‐ INIA—National  Plant  Genetic  Resources  Centre‐National  Institute  for  Agricultural  and  Food  Technology  Research,  Spain;  INIAV—Instituto  Nacional  de  Investigação  Agrária  e  Veterinária,  Portugal;  IPK—Leibniz  Institute  of  Plant  Genetics  and  Crop  Plant  Research,  Germany;  UCR— University  of  California  Riverside,  USA;  UTAD—Universidade  de  Trás‐os‐Montes  e  Alto  Douro,  Portugal.  In the first stage (Figure 1a), 6 seeds of each cowpea genotype were sowed individually in the  polyvinyl chloride (PVC) pipes, completely randomized on the 28th of June 2019. These pipes were  30 cm in height and 12.5 cm in diameter, were filled with a mixture of vermiculite, soil and peat  (1.5:3:6) and were watered to field capacity. After 30 days of plant development, the water stress was  imposed on half of the replicates by placing the 30 cm pipes on top of 60 cm pipes, previously filled  with the same soil mixture of the 30 cm pipes and watered to ensure water conductivity between both  pipes (Figure 1b). This was the timepoint for the onset of drought stress. Plants in the 30 cm pipes  and 90 cm pipes are hereafter designated as control and stress, respectively. The trial was conducted  during the next 42 days, which amounted to a final duration of 72 days since sowing took place. The  Agronomy 2020, 10, 1604  4  of  20  pipes were placed on top of a wood tray that was leveled and impermeabilized with a plastic sheet.  This made it possible to irrigate the base of the pipes with a thin layer of water during the first 35  days upon drought imposition. The bottom of the pipes had 4 holes of 0.5 cm diameter to ensure  water absorption. This prevented complete dehydration of the pipes and ensured that water would  be available in the deepest soil layers. No water was supplied in the last 7 days of the trial.  Figure  1.  Graphical  representation  of  the  experimental  trial.  Sowing  of  6  replicates  per  genotype  occurred in pipes with 30 cm in height (a). At the end of 30 days, half of the replicates in the 30 cm   height of 90 cm (b). The pipes were submerged  pipes were put on top of 60 cm pipes to obtain a final in a thin layer of water to ensure that deeper layers remained humid.  2.2. Climate Data and Soil Water Content  Air  temperatures  during  the  trial  were  recorded  by  a  weather  station  positioned  at  the  experimental location. Daily mean (Tmean), maximum (Tmax) and minimum (Tmin) air temperature were  measured and averaged for each month (Figure 2).  Figure 2. Minimum, maximum and mean air temperatures (°C) registered for the months throughout  the  experiment.  Tmax—maximum  air  temperature;  Tmin—minimum  air  temperature;  Tmean—mean  temperature.  For the soil water content (SWC) measurements, six additional 30 cm pipes were sowed with a  cowpea genotype and submitted to control and drought stress following the steps described in “2.1.  Plant material and experimental design”. The pipes’ SWC was monitored 14, 28 and 42 days after  Agronomy 2020, 10, 1604  5  of  20  drought stress imposition. For each measurement, a pipe of 30 and 90 cm was cut in two and six  sections of 15 cm, respectively, and the soil was weighed before and after drying at 100 °C for 72 h.  The SWC, on a dry mass basis, was calculated according to Muñoz‐Perea et al. [22] as follows:  Mw Ms 𝐶 % 100  Ms where Mw and Ms correspond to the mass of soil (g) before and after drying, respectively.  2.3. Data Collection  The days to germination (DG) and to first flower (DFF) were recorded for each plant. Seeds were  considered germinated when hypocotyl was visible. By the end of the experiment, all plants were  carefully removed from the pipes and the soil attached to the roots was rinsed with running water.  Root, shoot and pods were separated and dried at 80 °C for 72 h to obtain root dry weight (RDW),  shoot dry weight (SDW) and pod dry weight (PDW). Root:shoot ratio (RSR) was calculated as the  quotient between RDW and SDW. The total number pods per plant (NPP) was counted and classified  as “no grain” (pod without grains), “immature” (pods with not fully developed grains) and “mature”  (pods with fully developed grains). The grains from immature and mature pods were counted to  obtain the total number grains per plant (NGP). As all the genotypes shared the same erect growth  habit, plant height (PH) was defined as the length of the main stem in cm from ground level to the  tip of the plant [23]. The stem greenness (SG) was scored on a scale of 0 to 5, with 0 being “completely  yellow” and 5 “completely green” following Muchero et al. [14].  2.4. Data Analysis  Means and standard deviations (SD) for each of the traits were calculated based on the replicates  for each genotype and treatment (n = 3). A non‐parametric two‐way analysis of variance (Aligned  Ranks  Transformation  ANOVA)  was  performed  to  assess  the  effect  of  genotype,  water  stress  treatment  and  interaction  between  them.  For  each  genotype,  differences  between  both  water  treatments were assessed using the Mann‐Whitney test. All statistical analyses were performed using  R (version 3.6.3) and a p‐value of <0.05 was considered significant. The principal component analysis  (PCA) was performed using Past (version 4.0) [24]. For the PCA, the ratio between the mean of the  three  replicates  for  each  genotype  in  control  and  drought  treatments  was  calculated  and  then  transformed  to  Z  scores  by  subtracting  the  mean  value  measured  in  each  parameter  (obs−μ)  and  dividing the result by the respective standard deviation (σ) as follows:  𝑠 µ 𝑍 𝑒   where  obs  represents  the  observed  measurement.  The  same  software  was  used  to  elaborate  a  hierarchical clustering based on the Manhattan distances between the ratios of the measured SDW  under  drought  and  control  treatments  using  the  UPGMA  (unweighted  pair  group  method  with  arithmetic mean) method. For the heat map, the measurements were first normalized to percentage  accordingly  to  the  minimum  and  maximum  values  obtained  in  each  parameter.  All  graphical  representations were created using GraphPad Prism (version 8.0.0).  3. Results and Discussion  3.1. Soil Water Conditions  Several parameters have been described as indicators of water deficit in crop plants, including  plant‐based parameters, such as stomatal conductance and biochemical markers (e.g., proline and  anthocyanins contents), and soil‐based parameters such the SWC, which seem to be indicative of  water stress condition [15,25–27]. The differences in the SWC during the trial period are summarized  in Figure 3. Soil humidity gradually decreased in all pipes and this decrease was more evident in the  90 cm pipes (drought stress). Nonetheless, the bottom layers were always more humid than the upper  layers, indicating that a successful water content deficit between both ends of the pipes was obtained.  In the upper soil layers of the drought stress pipes, a more accentuated decrease in the water content  𝑜𝑟𝑠𝑐 𝑜𝑏 𝑆𝑊 Agronomy 2020, 10, 1604  6  of  20  could be observed comparatively to the control pipes. The same result was also achieved by Iseki et  al.  [15].  During  the  first  28  days  of  drought  treatment,  humidity  levels  in  control  pipes  were  maintained  between  27  and  89%,  in  the  0–15  cm  and  15–30  cm  soil  layers,  respectively,  while  humidity levels of these layers in drought stress pipes varied from 8 to 21%. The soil water content  levels across different depths in the 90 cm pipes show an uniform increase in humidity towards the  bottom of the pipes, which is similar to what occurs in field and was observed in a previous study of  Gebre and Earl in soybean [26]. In these measurements, it was possible to observe roots in the bottom  layers of the pipes, suggesting that plants under drought stress treatment had to develop deeper roots  in order to be able to reach more humid soil layers. A significant decrease in water content of the  deepest layers was observed at the 42nd day, as a result of ending the water supply through the  bottom of the pipes. At the end of the experiment, the SWC in the drought stress pipes in all the  depths  was very low  (<15%), while  in the  control pipes the SWC was approximately 50%. These  results indicate that the conditions used in this experiment were adequate, confirming that genotypes  in the pipes of 90 cm were effectively under drought stress conditions. Moreover, as mentioned by  Gebre and Earl [26], experiments that explore plant‐water relationships using rooting cylinder, as  opposed to small pots, allow a more realistic simulation of drought in field environments and allow  further  information  on  root  development,  namely  rooting  depth  [26].  Kashiwagi  et  al.  [27]  also  revealed that a cylinder protocol in chickpea could be a good choice for screening root traits.  Figure 3. Soil water content (SWC) in different depths (from pipes’ top to base) of control (a, from 0  to  30  cm)  and  stress  pipes  (b,  from  0  to  90  cm)  measured  in  3  different  days  after  imposition  of  drought.  3.2. Evaluation of Agro‐Morphological Parameters  For all evaluated parameters, the effect of treatment and genotype was significant (p < 0.05),  except for the treatment on DFF (Table 2). The genotype × treatment interaction was significant (p <  0.05) for the majority of the evaluated parameters except PH, RDW and DFF, indicating that the effect  of the drought treatment differed between genotypes. Apart from DFF, results showed an overall  reduction in the above‐ground parameters’ measurements (SDW, PH, SG, NPP, PDW and NGP) in  the  drought  stress  treatment  compared  to  the  control.  Contrarily,  root‐related  parameters  were  increased under drought stress conditions (Figure 4) suggesting that cowpea drought tolerance may  be related to the development of the root system.  Agronomy 2020, 10, 1604  7  of  20  Table 2. Aligned Rank Transformation ANOVA analysis of the different measured parameters in the  29 studied cowpea genotypes under control (30 cm pipes) and drought stress (90 cm pipes) at 42 days  of water stress.  Parameter    Source  DF *  Residual DF  F  Prob < F  Treatment  1  116  293.1  <0.001  SDW  Genotype  28  116  3.1  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  2.7  <0.001  Treatment  1  116  13.493  <0.001  PH  Genotype  28  116  6.6  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  1.2  0.234  Treatment  1  112  253.5  <0.001  PDW  Genotype  27  112  4.6  <0.001  Treatment: Genotype  27  112  2.6  <0.001  Treatment  1  116  130.5  <0.001  SG  Genotype  28  116  6.9  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  2.3  0.001  Treatment  1  112  151.5  <0.001  NPP  Genotype  27  112  5.3  <0.001  Treatment: Genotype  27  112  2.1  0.004  Treatment  1  112  186.8  <0.001  NGP  Genotype  27  112  5.2  <0.001  Treatment: Genotype  27  112  4.4  <0.001  Treatment  1  116  15.5  <0.001  RDW  Genotype  28  116  3.4  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  1.1  0.352  Treatment  1  116  294.6  <0.001  RSR  Genotype  28  116  3.3  <0.001  Treatment: Genotype  28  116  2.7  <0.001  Treatment  1  116  0.0  0.906  DFF  Genotype  28  116  5.1  <0.001     Treatment: Genotype  28  116  1.3  0.178   SDW—shoot dry weight; PH—plant height; PDW—pod dry weight; SG—stem greenness; NPP— number of pods per plant; NGP—number of grains per plant; RDW—root dry weight; RSR—root to  shoot ratio; DFF—days to first flower. * DF—degrees of freedom.  Figure 4. Variation percentage observed in the average of all cowpea genotypes in the drought stress  condition compared to the plants under control condition, after 42 days of drought stress treatments.  Agronomy 2020, 10, 1604  8  of  20  3.2.1. Shoot‐Related Parameters  SDW,  SG  and  PH  suffered  a  reduction  of  48.46,  28.95  and  11.40%,  respectively  (Figure  4).  Differences in the average of PH were relatively small between both treatments (136.68 and 121.10  cm  in  control  and  drought  treatments,  respectively),  with  only  C18,  C29,  C41  and  IT93K‐503‐1  genotypes presenting significant reductions (p < 0.05) (Figure 5b). Contrarily, differences in mean  SDW were significant (p < 0.05) (except for C15, C43, C47 and C58) with average mean values in  control plants being twice (17.24 g) the values recorded in plants under drought treatment (8.89 g)  (Figure  5a).  These  results  indicate  that  the  plants  were  able  to  maintain  similar  heights  in  both  treatments, but their shoot biomass was largely reduced. The reduction in SDW in cowpea under  drought stress conditions was also verified in other studies [28–30], including other Vigna species  [15], with this being considered a common effect of drought stress in legumes [31]. Plants with lower  shoot  biomass  are  likely  to  have  lower  water  consumption,  which  allows  them  to  maintain  an  adequate  water  status  under  drought  conditions  [15].  SG  is  an  important  indicator  of  drought  tolerance in cowpea genotypes at a seedling stage [14], but it is not commonly evaluated in cowpea  screenings at the vegetative and reproductive stage. In other crops, such as sorghum, the ability to  maintain  stem  greenness  under  drought  conditions  at  a  post‐flowering  stage  indicates  higher  drought tolerance [32]. SG was also clearly reduced under drought stress, in which the average of SG  across genotypes was 2.97, while, in control pipes, it was 4.18. Significant differences (p < 0.05) in SG  between treatments were found in the genotypes Bambey21, C18, C19, C23, C31, C41, C47, C52, C53  C58, C59, C8 and IT93K‐503‐1 (Figure 5c). Despite the treatment effect being non‐significant (p > 0.05) for DFF (Table 2), it was observed  that genotype C59 only reached flowering stage in the control treatment but not under drought stress,  indicating that water availability may have affected its flowering time (Table S1). Similarly, not all  replicates of the genotypes C11, C15, C41 and C52 reached flowering in drought treatment. However,  it was also observed that some replicates of the genotypes C41 and C59 also did not flower under  control  conditions.  All  genotypes,  with  the  exception  of  IT93K‐503‐1,  presented  similar  DFF,  suggesting  identic  photoperiod‐sensitivity.  Since  IT93K‐503‐1  did  not  reach  flowering,  it  was  not  included in the analysis of yield‐related parameters (PDW, NGP and NPP).  For the yield‐related parameters, namely PDW, NGP and NPP, considerable reductions were  also observed under drought stress (62.19, 58.66 and 45.48%, respectively) (Figure 4). The mean NPP  and NGP found in these drought stress treated plants (3.86 and 16.91g, respectively) was significantly  lower  than  the  means  observed  in the  control  plants  (7.08 and 40.93  g,  respectively).  Due to  this  decrease, total PDW in the drought stress treatment was 2.84 g, contrasting with 7.52 g in the control.  Significant differences (p < 0.05) between genotypes C23, C3, C41, C45, C49, C51, C52 and C53 were  found  in  all  yield  related  parameters  (NPP,  NGP  and  PDW),  demonstrating  a  clear  effect  of  the  drought stress in these genotypes (Figure 6). This significant decrease in the NPP, NGP and PDW  under drought stress for the genotypes C41 and C52 is in accordance with the absence of flowering  previously mentioned. Overall, PDW significantly decreased under drought conditions, while the  decreases in NPP and NGP were not so marked, wherein statistically significant differences were  only  found in  some  genotypes.  Genotypes  C15,  C19,  C31,  C43  and  C58 did  not  show  significant  differences (p > 0.05) in any of the yield‐related parameters (p < 0.05), suggesting a lower effect of  drought treatment. In the study developed by Mendes et al. [30], cowpea accessions, when subjected  to drought stress, were less affected in their source capacity (leaf related parameters) but presented  considerable reductions in their sink size, namely in the number of pods and grains per plant. Some  studies mention that the number of pods per plant in cowpea is much affected by drought stress, thus  being an important trait in studies of drought tolerance [30,33,34]. The number of pods might be the  major contributor to the decreased cowpea grain yield under drought stress [33]. Leite et al. [35],  performed a study where a specific cowpea genotype (cv. EMAPA‐821) was subjected to drought  stress in vegetative, pre‐flowering and pod filling phases, showing that the effect of drought was  most severe during pod filling. Based on these results, the authors suggested that the development  of less pods could be a drought tolerance mechanism used by this crop to seek for better conditions.  Agronomy 2020, 10, 1604  9  of  20  Figure 5. Differences in the shoot dry weight (SDW) (a), plant height (PH) (b) and stem greenness  (SG) (c) of the evaluated genotypes after 42 days in control and drought stress conditions. The data  presented corresponds to the means ± SD (error bars). * represents significant differences between  treatments according to Mann‐Whitney U Test at p < 0.05 level.  Agronomy 2020, 10, 1604  10  of  20  Figure 6.  Differences in  the pod dry  weight  (PDW)  (a),  number  of  pods  per  plant  (NPP)  (b)  and  number of grains per plant (NGP) (c) of the evaluated genotypes after 42 days under control and  drought stress conditions. The data presented corresponds to the means ± SD (error bars). * represents  significant differences between treatments according to Mann‐Whitney U Test at p < 0.05 level.  3.2.2. Root‐Related Parameters  The root system seems to be strongly related with drought tolerance in legumes [31] and has  been highlighted for its potential applicability in drought tolerance screenings in soybean (Glycine  max L.) [36,37], chickpea (Cicer arietinum L.) [18,27,38], common bean (Phaseolus vulgaris L.) [39,40],  faba bean (Vicia faba L.) [41] and lentil (Lens culinaris ssp. culinaris Medikus) [42]. In cowpea, root traits  were suggested to have an important role in drought avoidance [12] but their use in drought tolerance  screenings is still not commonly applied, as they might involve complicated procedures using specific   require access to recently developed imaging techniques and high‐throughput  chambers that often phenotyping software that allow the visualization of the three dimensional distribution of the root in  the  soil  [16,43].  Different  legume  crops  present  distinct  responses  to  drought  regarding  root  development: common bean [39], faba bean genotypes [41] and soybean [37], show a reduced root  development, while, in chickpea genotypes [18,27,38] and in some species of the genus Vigna [15],  root growth seems to be stimulated. Moreover, Iseki et al. [15] verified that the genotypes’ tolerance  Agronomy 2020, 10, 1604  11  of  20  levels were different between terminal and non‐terminal drought treatments. Hence, the effect of  drought in the root development varies among species and the type of drought stress imposed.  To avoid interpretation errors that could be induced by the differential size of the control and  stress tubes, the root length data is not shown. Our results show that root‐related parameters varied  differently from the shoot‐related parameters. Contrarily to shoot‐related parameters, the RDW and  RSR were 24.57 and 136.98% higher, respectively, under drought stress conditions comparatively to  control  (Figure  4),  suggesting  that  droughted  plants,  overall,  prioritized  root  development  over  shoot. Accordingly, mean RDW was also higher in drought stress conditions (2.59 g) than in control  (2.08 g), although this increment was less pronounced (24.57%) and significant differences (p < 0.05)  were only observed in genotypes C11, C31, C52 and C53 (Figure 7a). The difference between mean  RSR in the two treatments was larger, varying from 0.13 to 0.31 in control and droughted plants,  respectively. All genotypes, except Bambey21, C15, C58 and C59, showed significant differences (p <  0.05) in the RSR between the two treatments (Figure 7b). Similar results were obtained by Gebre and  Earl  [26]  in  soybean,  where  RSR  increased  by  18%  under  drought  conditions.  In  other  crops,  an  increased RSR in response to drought stress was associated with more sucrose being transported  from leaves to roots [44]. In Vigna species, Iseki et al.’s [15] study showed that deeper roots alone do  not  guarantee  enough  water  absorption  to  sustain  shoot  growth.  Rather,  a  greater  root  biomass,  which  suggests  a  higher  number  of  roots,  appears  to  be  a  key  factor  to  overcome  poor  water  absorption. More tolerant genotypes seem to increase RDW when subjected to drought stress, while  susceptible genotypes decreased RDW. The increased root biomass under drought conditions might  be related to the accumulation of abscisic acid (ABA) in the roots [45]. Moreover, roots with higher  biomass values are associated with an increased hydraulic conductivity that allows better tolerance  to drought conditions [46].  Figure 7. Differences in the root dry weight (RDW) (a), and root:shoot ratio (RSR) (b) of the evaluated  genotypes after 42 days under control and drought stress conditions. The data presented corresponds  to  the  means  ±  standard  deviations  (error  bars).  *  represents  significant  differences  between  treatments according to Mann‐Whitney U Test at p < 0.05 level.  Agronomy 2020, 10, 1604  12  of  20  3.3. Principal Component Analysis  In  this  study,  we  performed  a  PCA  in  order  to  determine  the  most  contributive  agro‐ morphological traits for the distribution of this set of genotypes in the two treatments (Table 3; Figure  8)  and,  consequently,  the  traits  that  could  be  contributing  the  most  to  drought  tolerance.  PCA  distribution based on parameters of interest has been considered a useful complementary tool in  drought  tolerance  screenings  and,  consequently,  in  the  selection  of  the  most  tolerant  genotypes,  namely in drought tolerance screenings of cowpea [47] and other crops, such as common bean [48],  chickpea  [49]  and  bread  wheat  [50].  Results  showed  that  the  first  three  principal  components  presented  eigenvalues  superior  to  1,  and  together  explained  81.72%  of  the  total  variation  (PC1:  40.57%,  PC2:  21.73%  and  PC3:  19.42%)  (Table  3).  The  first  principal  component  was  primarily  associated with yield components (NPP, PDW and NGP), while the second principal component was  more  correlated  with  the  evaluated  root  characteristics  (RDW  and  RSR)  and  the  third  principal  component with SDW and PH.  Our results show that NPP, PDW and NGP were the most contributive factors for the dispersion  of the genotypes along the PC1 axis. At the seedling stage, Nkomo et al. [47] also denoted a heavy  contribution  of  pod  and  grain  related  components,  namely  PDW,  for  the  screening  of  drought  tolerant cowpea genotypes. Alidu [51] observed that the reduction in shoot biomass as the result of  drought imposition at the vegetative phase is one of the main reasons for a decreased yield. Our  results seem to corroborate this observation, since genotypes with higher SDW also present a higher  number of pods and grains per plant. In contrast, a negative correlation between average grain yield  and shoot length, root length and fresh and dry weight of the plants was found in chickpea genotypes  under drought stress [49]. Furthermore, Alidu [51] denoted a linear correlation between NPP and  grain yield, thus suggesting that the pod number can act as an indicator of potential yield.  RDW  and  RSR  were  the  main  contributing  factors  to  the  variation  along  the  PC2  axis,  establishing a positive association. In bread wheat (Triticum aestivum L.) genotypes, RSR also was  among the main contributing characteristics to the variation observed under drought conditions [50].  RDW, among other traits, was identified by Abdou Razakou et al. [52] as a reliable parameter for the  screening of drought tolerant cowpea seedlings. According to Wasaya et al. [17], root phenotyping is  as  important  as  shoot  phenotyping,  since  roots  are  the  main  responsible  organ  for  the  plant’s  performance in relation to water and nutrient absorption. The negative association of SDW, SG and,  to  some  extent,  PH  in  PC2  indicates  that  drought  stressed  genotypes  are  either  increasing  shoot  biomass at the expense of root biomass or the opposite. This result has also been observed in other  studies [15,51].  The variation observed in PC3 was predominantly and positively associated with SDW and PH.  Higher shoot height and biomass likely translates to a larger photosynthetic apparatus able to sustain  higher grain yield [51]. However, in the study of Ayala et al. [53], an inversed correlation between  shoot development (SDW and PH) and water use efficiency was observed, suggesting that greater  shoot  development  leads  to  a  higher  loss  of  water  being  prejudicial  under  drought  conditions.  Likewise, Iseki et al. [15] also found shoot biomass to be related with plant water status, where lower  shoot biomass could confer better drought tolerance.  The distribution of the genotypes based on the effects of drought stress relative to control for all  parameters suggests a wide variability of the studied genotypes. This variability was expected as the  cowpea  genotypes  had  origins  in  different  worldwide  countries.  However,  the  dispersion  of  the  genotypes in the PCA did not reflect any obvious groupings based on similar origins. This result is  in  accordance  with  a  previous  study  [19].  All  evaluated  parameters  revealed  considerable  contributions  to  the  variation  observed  between  genotypes  under  drought  treatment.  This  phenotypic  variability  under  drought  stress  might  represent  an  important  resource  for  plant  breeders.  Agronomy 2020, 10, 1604  13  of  20  Table 3. Principal component analysis (PCA) of the effect of drought treatment on morphological  parameters from 29 cowpea genotypes. Measured values under drought treatment were divided by  the respective control to obtain a ratio between both treatments.  Parameters   PC 1  PC 2  PC3  SDW  0.29 −0.26  0.51  PH −0.05 −0.01  0.67  SG −0.29 −0.23  0.37  NPP  0.49  0.05  0.06  PDW  0.54  0.10 −0.01  RDW  0.08  0.62  0.38  NGP  0.51  0.05 −0.12  RSR −0.20  0.69  0.01  Eigenvalue  3.36  1.80  1.61  % variance  40.57  21.73  19.42   SDW—shoot dry weight; PH—plant height; PDW—pod dry weight; SG—stem greenness; NPP— number of pods per plant; NGP—number of grains per plant; RDW—root dry weight; RSR—root to  shoot ratio.  Figure 8. Principal component analysis (PCA) of the effect of drought treatment in 29 genotypes.  Measured values under drought treatment were divided by the respective control to obtain a ratio  between  both  treatments  (control—white  squares;  drought—black  dots).  The  lines  indicate  eigenvectors representing the strength (given by the length of the vector) and the direction of the  parameter correlation relative to the first two principal components (PC1 and PC2). SDW—shoot dry  weight; SG—stem greenness; PH—plant height; NPP—number of pods per plant; NGP—number of  grains per plant; PDW—pods dry weight; RDW—root dry weight; RSR—root:shoot ratio.  3.4. Screening for Drought Tolerant Genotypes  A  dendrogram  was  elaborated  based  on  the  ratio  of  SDW  between  drought  treatment  and  control  for  each  genotype  (Figure  9).  Relative  SDW  translates  into  how  much  vegetative  growth  (expressed as shoot biomass) was affected by drought, and hence was used as a drought tolerance  indicator. As suggested by the PCA, drought tolerance in cowpea seems to result from a complex of  traits that can act simultaneously or singly and vary between different genotypes. The complexity  and variability of the traits related to drought tolerance has been observed in previous studies [12,54].  Hence, the use of different traits, such as the ones here presented, might provide a more complete  resource  of  phenotypic  diversity  to  drought  tolerance  breeding.  In  order  to  assess  the  resulting  Agronomy 2020, 10, 1604  14  of  20  clustering in a more integrated and holistic manner, a heat map with the ratios of SDW, PH, SG, RDW  and RSR between drought and control treatment was included (Figure 9). This made it possible to  make inferences about how the different traits combine with vegetative growth and which genotypes  present the most interesting set of characteristics that might confer drought tolerance. Since drought  was imposed at an early vegetative phase, not all plants were able to produce fully matured grains  (hence the overall low number of mature pods seen in table S2). Therefore, all parameters related to  the reproductive phase (PDW, NGP and NPP) were not used for the screening of the most drought  tolerant genotypes.  Figure 9. Analysis of morphological characteristics on 29 cowpea genotypes under drought stress (90  cm pipes) relative to control (30 cm pipes). The dendrogram shows the Manhattan distances between  genotypes based on the ratio of SDW between drought treatment and control using UPGMA method.  The  heat  map  shows  the  ratios  of  SDW,  PH,  SG,  RDW  and  RSR  between  drought  and  control  treatment obtained for each genotype, normalized to percentage, where 0 and 100% represents the  minimum and maximum values registered in each parameter. SDW—shoot dry weight; SG—stem  greenness; RDW—root dry weight; RSR—root: shoot ratio.  Agronomy 2020, 10, 1604  15  of  20  The clustering divided this set of genotypes into two main groups (I and II) that were further  subdivided  into  A,  B,  C  and  D  and  E  subgroups,  respectively.  Group  I  comprised  most  of  the  evaluated genotypes. Drought stimulated a lower reduction in shoot biomass in the genotypes from  subgroup  A (48%)  than those  observed  in  genotypes from subgroups  B (56%)  and  C (67%).  This  subgroup A includes IT93K‐503‐1, the drought tolerant reference. Despite all genotypes in subgroup  A having similar relative SDW, the same homogeneity was not observed in the other parameters.  Regarding root parameters (RDW and RSR), C5, C24, C39, C51 and C57 genotypes presented the  highest  increases  under  drought  treatment,  whilst  the  opposite  was  found  in  C21,  C23,  C29  and  IT93K‐503‐1 genotypes. SG was maintained in genotypes C5, C20, C21, C23, C29, C39, C49 and IT93K‐ 503‐1. When subjected to drought at the seedling stage, IT93K‐503‐1 also maintained SG, and this  phenotype was related to higher drought tolerance [14]. Similarly, maintenance of SG under drought  conditions is also an indicator of delayed senescence, and thus, drought tolerance [54]. Despite being  considered drought tolerant, the IT93K‐503‐1 genotype still suffered a reduction in shoot biomass.  This could be explained as a response to drought, where shoot metabolism is deactivated to lower  the  uptake  of  nutrients  and  water  [55].  Genotypes  in  subgroup  B  (composed  by  Bambey21,  the  drought  susceptible  reference  genotype  and  C8,  C18,  C22,  C41,  C45  and  C53  genotypes)  and  subgroup  C  (C3  and  C52  genotypes)  presented  the  highest  reductions  in  SDW  under  drought  treatment, thus being considered the most susceptible to drought. Despite being the most affected by  drought  treatment  in  terms  of  shoot  biomass,  genotypes  C52  and  C3  were  able  to  maintain  SG,  suggesting that shoot biomass reduction might have allowed maintenance of a more adequate plant  water status. Overall, genotypes from subgroup B and C were characterized by low scores in all  evaluated parameters, with some exceptions. C45, C52 and C53 presented superior values of relative  RDW and RSR and were able to maintain their stem greenness under drought conditions. Contrarily,  Bambey21 clearly differentiates from the rest of genotypes in subgroups B and C by the affected root  development  in  terms  of  RDW  and  RSR.  The  Bambey21  genotype  has  been  demonstrated  to  be  susceptible to drought stress in previous works [14,25,56,57]. Contrarily to most of the remaining  genotypes, in which drought promoted the allocation of biomass to root, the RDW of Bambey21 was  slightly  decreased.  Nonetheless,  this  decrease  was  non‐significant  (p  >  0.05).  RSR  was  slightly  increased under drought stress, probably due to a more intense reduction in shoot biomass. The role  of root development in drought tolerance, among other factors, might explain the susceptibility of  this genotype. Similar to our results, in the study of Ogbonnaya et al. [57], Bambey21 presented lower  root biomass and RSR than the other tested genotypes. In light of these results, we hypothesized that  low RDW and RSR could be related to the increased susceptibility of cowpea. Finally, subgroup C  consists of the two genotypes (C3 and C52) with the lowest relative SDW, indicating that vegetative  growth was severely affected by drought treatment.  Group II comprises the genotypes with the highest relative SDW, suggesting that these were the  least  affected  by  drought  in  the  vegetative  growth.  Interestingly,  under  control  conditions,  the  genotypes in subgroup D (C11, C31, C47, C56, and C59) and E (C15, C43 and C58) presented the  lowest  SDW  among  all  genotypes.  These  genotypes  were  also  the  ones  that  suffered  the  least  reduction under drought treatment (SDW reduction percentages in subgroups D and E were 37 and  22%, respectively). Previous studies have showed that genotypes with smaller shoot biomass achieve  better water status and thus are more able to tolerate drought [15,52]. Even though a higher shoot  biomass could lead to detrimental water losses through transpiration under drought conditions [15],  an increase in net photosynthesis, as a consequence of a higher number of leaves, might support a  higher accumulation of dry matter in pods, thus promoting a better yield [31,51]. Although genotypes  in subgroup E maintained a higher shoot biomass compared to subgroup D, the genotypes in the last‐ mentioned  subgroup  presented  a  better  performance  in  the  rest  of  the  evaluated  parameters,  particularly regarding RDW. The importance of root traits to drought tolerance in cowpea has been  suggested in previous works [12], wherein root biomass seems to play an important role in a greater  water absorption capacity [15]. One of the mechanisms of drought tolerance in common bean seems  to involve a higher secondary lateral root development [39], which possibly translates into higher  root biomass. Our results show that genotypes that were able to develop higher root biomass under  Agronomy 2020, 10, 1604  16  of  20  drought treatment (particularly genotypes in subgroup D) were able to sustain shoot development  with  smaller  reductions  in  SDW,  PH  and  SG  relatively  to  control  conditions.  In  light  of  these  observations, increasing root biomass might confer higher drought tolerance. Therefore, subgroup D  seems to group the genotypes better adapted to drought regarding both root and shoot development,  with the exception of C31 and C59, which presented considerable reductions in shoot (PH and SG)  and root traits (RDW and RSR), respectively. Our results made it possible to corroborate a previous  study where C11 and C47 genotypes were classified as drought tolerant at the germination level [13].  The indication that some of these genotypes are also drought tolerant at the germination level further  reveals their importance for future breeding programs. As a final remark, reductions in NPP, NGP  and PDW varied greatly among the evaluated genotypes. In group II, the subgroup E, particularly  C43  and  C58,  was  less  affected  than  genotypes  in  subgroup  D  in  the  NPP,  NGP  and  PDW.  The  genotypes  C31,  C43,  C56  and  C58  suffered  reductions  inferior  to  50%  in  NPP,  NGP  and  PDW,  indicating that these genotypes might be able to provide better yield under drought conditions than  the remaining genotypes in group II. Contrarily, genotypes C15 and C59 were severely affected, with  little to no production of pods under drought treatment. However, as previously mentioned, further  studies that focus on yield are required and the data here presented should be only interpreted as  indicators of potential yield under drought stress.  4. Conclusions  Cowpea is known for its drought tolerance and thus is considered an important legume crop to  face the future constrains due to climate change. Our results show that when subjected to an intense  drought stress, cowpea seems to prioritize root development over shoot, which reflected the overall  significant  reduction  in  SDW,  SG,  PDW,  NPP  and  NGP,  whereas  RDW  and  RSR  significantly  increased.  PCA  depicted  that  all  evaluated  parameters  had  considerable  contributions  for  the  variation observed between both water treatments among genotypes, indicating that besides above‐ ground  characteristics,  root‐related  parameters  are  also  important  factors  for  drought  tolerance  screenings in cowpea. The hierarchical clustering of the genotypes under drought stress based on  vegetative growth retardation (differences in shoot biomass between control and drought conditions)  revealed that the majority of the genotypes with the least reductions in shoot biomass under drought  conditions also presented the highest increases in root biomass, suggesting the importance of this  trait  to  drought  tolerance.  In light  of these  results, a  set  of  genotypes  with  the  lowest  vegetative  growth retardation was identified, namely C11, C15, C31, C43, C47, C56, C58 and C59. From this  group, the most drought tolerant genotypes were C11, C47 and C56 since these showed generally  higher drought/control ratios in all measured parameters. It is important to mention that, being the  result of several mechanisms, drought tolerance variations cannot be explained only by a simple  tolerance  factor.  In  further  cowpea  experiments  using  pipes  methodologies  exploring  root  morphology and its role in drought tolerance, it would be advantageous the use of pipes of equal  height and to complement plants’ agro‐morphological performance with physiological, biochemical  and other developmental responses.  Supplementary Materials: The following are available online at www.mdpi.com/2073‐4395/10/10/1604/s1, Table  S1: Days to germination and flowering expressed as means ± standard deviations of the replicates (n = 3) for each  genotype and Table S2: Percentage of immature (I), mature (M) and no grain (N) pods for each genotype under  control and drought conditions.  Author Contributions: Conceptualization, V.C. and I.C.; methodology, R.S., M.C., V.C. and I.C.; formal analysis,  R.S. and M.C.; investigation, R.S. and M.C.; resources, V.C. and I.C.; data curation, R.S., M.C., V.C. and I.C.;  writing—original draft preparation, R.S.; writing—review and editing, M.C., E.R., V.C., I.C.; supervision, M.C.,  V.C. and I.C.; project administration, V.C. and I.C.; funding acquisition, V.C. and I.C. All authors have read and  agreed to the published version of the manuscript.  Funding:  This  research  was  funded  by  National  Funds  by  FCT—Portuguese  Foundation  for  Science  and  Technology, under the project grant number UIDB/04033/2020.  Agronomy 2020, 10, 1604  17  of  20  Acknowledgments:  The  authors  would  like  to  thank  the  Agricultural  University  of  Athens  (AUA,  Greece),  Botanic  Garden  Meise  (BGM,  Belgium),  National  Plant  Genetic  Resources  Centre‐National  Institute  for  Agricultural and Food Technology Research (CRF‐INIA, Spain), Instituto Nacional de Investigação Agrária e  Veterinária—Elvas (INIAV‐Elvas, Portugal), Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK,  Germany) and University of California Riverside (UCR, USA) for providing seeds, and Professor Raúl Morais  for providing climate data.  Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.  References  1. Huang, S.; Li, P.; Huang, Q.; Leng, G.; Hou, B.; Ma, L. The propagation from meteorological to hydrological  drought and its potential influence factors. J. Hydrol. 2017, 547, 184–195, doi:10.1016/j.jhydrol.2017.01.041.  2. Leng, G.; Hall, J. Crop yield sensitivity of global major agricultural countries to droughts and the projected  changes in the future. Sci. Total Environ. 2019, 654, 811–821, doi:10.1016/j.scitotenv.2018.10.434.  3. Singh,  R.;  Singh,  H.;  Raghubanshi,  A.S.  Challenges  and  opportunities  for  agricultural  sustainability  in  changing  climate  scenarios:  A  perspective  on  Indian  agriculture.  Trop.  Ecol.  2019,  60,  167–185,  doi:10.1007/s42965‐019‐00029‐w.  4. FAOSTAT Food and Agriculture Organization of the United Nations—Statistics Division. Available online:  http://faostat3.fao.org/browse/Q/QC/E (accessed on 18 February 2020).  5. Watson, C.A.; Reckling, M.; Preissel, S.; Bachinger, J.; Bergkvist, G.; Kuhlman, T.; Lindström, K.; Nemecek,  T.; Topp, C.F.; Vanhatalo, A.; et al. Grain Legume Production and Use in European Agricultural Systems.  In Advances in Agronomy; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2017; Volume 144, pp. 235–303.  6. Gonçalves, A.; Goufo, P.; Barros, A.; Domínguez‐Perles, R.; Trindade, H.; Rosa, E.A.; Ferreira, L.; Rodrigues,  M. Cowpea (Vigna unguiculata L. Walp), a renewed multipurpose crop for a more sustainable agri‐food  system: Nutritional advantages and constraints. J. Sci. Food Agric. 2016, 96, 2941–2951, doi:10.1002/jsfa.7644.  7. Ofuya, Z.; Akhidue, V. The role of pulses in human nutrition: A review. J. Appl. Sci. Environ. Manag. 2006,  9, 99–104, doi:10.4314/jasem.v9i3.17361.  8. Carsky, R.J.; Vanlauwe, B.; Lyasse, O. Cowpea rotation as a resource management technology for cereal‐ based  systems  in  the  savannas  of  West  Africa.  In  Challenges  and  Opportunities  for  Enhancing  Sustainable  Cowpea Production; Fatokun, C.A., Tarawali, S.A., Singh, B.B., Kormawa, P.M., Tamò, M., Eds.; International  Institute of Tropical Agriculture: Ibadan, Nigeria, 2002; pp. 251–266.  9. Hall,  A.E.  Breeding  for  adaptation  to  drought  and  heat  in  cowpea.  Eur.  J.  Agron.  2004,  21,  447–454,  doi:10.1016/j.eja.2004.07.005.  10. Carvalho, M.; Lino‐Neto, T.; Rosa, E.; Carnide, V. Cowpea: A legume crop for a challenging environment.  J. Sci. Food Agric. 2017, 97, 4273–4284, doi:10.1002/jsfa.8250.  11. Herniter, I.; Muñoz‐Amatriaín, M.; Close, T. Genetic, textual, and archaeological evidence of the historical  global spread of cowpea (Vigna unguiculata [L.] Walp). Legume Sci. 2020, e57, doi:10.1002/leg3.57  12. Agbicodo, E.M.; Fatokun, C.A.; Muranaka, S.; Visser, R.G.F.; Van Der, C.G.L. Breeding drought tolerant  cowpea:  Constraints,  accomplishments,  and  future  prospects.  Euphytica  2009,  167,  353–370,  doi:10.1007/s10681‐009‐9893‐8.  13. Carvalho,  M.;  Matos,  M.;  Castro,  I.;  Monteiro,  E.;  Rosa,  E.;  Lino‐Neto,  T.;  Carnide,  V.  Screening  of  worldwide cowpea collection to drought tolerant at a germination stage. Sci. Hortic. 2019, 247, 107–115,  doi:10.1016/j.scienta.2018.11.082.  14. Muchero,  W.;  Ehlers,  J.D.;  A  Roberts,  P.  Seedling  Stage  Drought‐Induced  Phenotypes  and  Drought‐ Responsive  Genes  in  Diverse  Cowpea  Genotypes.  Crop.  Sci.  2008,  48,  541–552,  doi:10.2135/cropsci2007.07.0397.  15. Iseki, K.; Takahashi, Y.; Muto, C.; Naito, K.; Tomooka, N. Diversity of Drought Tolerance in the Genus  Vigna. Front. Plant Sci. 2018, 9, 1–18, doi:10.3389/fpls.2018.00729.  16. Matsui, T.; Singh, B.B. Root Characteristics in Cowpea Related to Drought Tolerance at the Seedling Stage.  Exp. Agric. 2003, 39, 29–38, doi:10.1017/s0014479703001108.  17. Wasaya, A.; Zhang, X.; Fang, Q.; Yan, Z. Root Phenotyping for Drought Tolerance: A Review. Agronomy  2018, 8, 241, doi:10.3390/agronomy8110241.  Agronomy 2020, 10, 1604  18  of  20  18. Ramamoorthy, P.; Lakshmanan, K.; Upadhyaya, H.D.; Vadez, V.; Varshney, R.K. Root traits confer grain  yield advantages under terminal drought in chickpea (Cicer arietinum L.). Field Crop. Res. 2017, 201, 146–161,  doi:10.1016/j.fcr.2016.11.004.  19. Carvalho, M.; Bebeli, P.J.; Pereira, G.; Castro, I.; Egea‐Gilabert, C.; Matos, M.; Lazaridi, E.; Duarte, I.; Lino‐ Neto, T.; Ntatsi, G.; et al. European cowpea landraces for a more sustainable agriculture system and novel  foods. J. Sci. Food Agric. 2017, 97, 4399–4407, doi:10.1002/jsfa.8378.  20. Carvalho,  M.; Castro,  I.;  Matos,  M.;  Lino‐Neto,  T.;  Silva, V.;  Rosa, E.;  Carnide,  V.  Caracterização  agro‐ morfológica  de  acessos  de  feijão‐frade  (Vigna  unguiculata):  Bases  para  o  melhoramento.  Rev.  Ciências  Agrárias 2016, 39, 506–517, doi:10.19084/RCA16091.  21. Martos‐Fuentes, M.; Cellini, A.; Ochoa, J.; Carvalho, M.; Carnide, V.; Rosa, E.; Pereira, G.; Barcelos, C.;  Bebeli, P.J.; Egea‐Gilabert, C. Genotype by environment interactions in cowpea (Vigna unguiculata L. Walp.)  grown in the Iberian Peninsula. Crop. Pasture Sci. 2017, 68, 924–931, doi:10.1071/cp17071.  22. Muñoz‐Perea, C.G.; Allen, R.G.; Westermann, D.T.; Wright, J.L.; Singh, S.P. Water use efficiency among dry  bean landraces and cultivars in drought‐stressed and non‐stressed environments. Euphytica 2007, 155, 393– 402, doi:10.1007/s10681‐006‐9340‐z.  23. Mfeka, N.; Mulidzi, A.; Lewu, F.B. Growth and yield parameters of three cowpea (Vigna unguiculata L.  Walp)  lines  as  affected  by  planting  date  and  zinc  application  rate.  South  Afr.  J.  Sci.  2018,  115,  1–8,  doi:10.17159/sajs.2019/4474.  24. Hammer, Ø.; Harper, D.A.T.; Ryan, P.D. PAS: Paleontological Statistics Software Package for Education  and Data Analysis. Palaentologia Electron. 2001, 4, 1–9.  25. Carvalho, M.; Castro, I.; Moutinho‐Pereira, J.; Correia, C.; Egea‐Cortines, M.; Matos, M.; Rosa, E.A.; Carnide,  V.; Lino‐Neto, T. Evaluating stress responses in cowpea under drought stress. J. Plant Physiol. 2019, 241,  153001, doi:10.1016/j.jplph.2019.153001.  26. Gebre, M.G.; Earl, H.J. Effects of Growth Medium and Water Stress on Soybean [Glycine max (L.) Merr.]  Growth, Soil Water Extraction and Rooting Profiles by Depth in 1‐m Rooting Columns. Front. Plant Sci.  2020, 11, 11, doi:10.3389/fpls.2020.00487.  27. Kashiwagi,  J.;  Krishnamurthy,  L.;  Crouch,  J.;  Serraj,  R.  Variability  of  root  length  density  and  its  contributions to seed yield in chickpea (Cicer arietinum L.) under terminal drought stress. Field Crop. Res.  2006, 95, 171–181, doi:10.1016/j.fcr.2005.02.012.  28. Zegaoui, Z.; Planchais, S.; Cabassa, C.; Djebbar, R.; Belbachir, O.A.; Carol, P. Variation in relative water  content, proline accumulation and stress gene expression in two cowpea landraces under drought. J. Plant  Physiol. 2017, 218, 26–34, doi:10.1016/j.jplph.2017.07.009.  29. Agele, S.O.; Ofuya, T.I.; James, P.O. Effects of watering regimes on aphid infestation and performance of  selected varieties of cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) in a humid rainforest zone of Nigeria. Crop. Prot.  2006, 25, 73–78, doi:10.1016/j.cropro.2005.03.005.  30. Mendes, R.M.S.; Távora, J.A.; José, F.; Pitombeira, J.B.; Nogueira, J.M. Source‐sink relationships in cowpea  under drought stress. Rev. Ciência Agronômica 2007, 38, 95–103.Nadeem, M.; Li, J.; Yahya, M.; Sher, A.; Ma,  C.; Wang, X.; Qiu, L. Research Progress and Perspective on Drought Stress in Legumes: A Review. Int. J.  Mol. Sci. 2019, 20, 2541, doi:10.3390/ijms20102541.  31. Xu, W.; Subudhi, P.K.; Crasta, O.R.; Rosenow, D.T.; E Mullet, J.; Nguyen, H.T. Molecular mapping of QTLs  conferring  stay‐green  in  grain  sorghum  (Sorghum  bicolor  L.  Moench).  Genome  2000,  43,  461–469,  doi:10.1139/g00‐003.  32. Bastos,  E.A.;  do  Nascimento,  S.P.;  da  Silva,  E.M.;  Filho,  F.R.F.;  Gomide,  R.L.  Identification  of  cowpea  genotypes  for  drought  tolerance.  Rev.  Cienc.  Agron.  2011,  42,  100–107,  doi:10.1590/S1806‐ 66902011000100013..  33. Nascimento, J.T.; Pedrosa, M.B.; Sobrinho, J.T. Efeito da variação de níveis de água disponível no solo sobre  o  crescimento  e  produção  de  feijão  caupi,  vagens  e  grãos  verdes.  Hortic.  Bras.  2004,  22,  174–177,  doi:10.1590/s0102‐05362004000200002.  34. Leite, M.D.L.; Rodrigues, J.D.; Virgens Filho, J.S. Das Efeitos do déficit hídrico sobre a sultura do caupi, cv‐ EMAPA‐821. III‐Produção. Rev. Agric. 2000, 75, 9–20, doi:10.37856/bja.v75i1.1270.  35. Prince, S.J.; Murphy, M.; Mutava, R.N.; Zhang, Z.; Nguyen, N.; Kim, Y.H.; Pathan, S.M.; Shannon, G.J.;  Valliyodan, B.; Nguyen, H.T. Evaluation of high yielding soybean germplasm under water limitation. J.  Integr. Plant Biol. 2016, 58, 475–491, doi:10.1111/jipb.12378.  Agronomy 2020, 10, 1604  19  of  20  36. Gao, X.‐B.; Guo, C.; Li, F.; Li, M.; He, J. High Soybean Yield and Drought Adaptation Being Associated with  Canopy  Architecture,  Water  Uptake,  and  Root  Traits.  Agronomy  2020,  10,  608,  doi:10.3390/agronomy10040608.  37. Kashiwagi, J.; Krishnamurthy, L.; Upadhyaya, H.D.; Krishna, H.; Chandra, S.; Vadez, V.; Serraj, R. Genetic  variability  of  drought‐avoidance  root  traits  in  the  mini‐core  germplasm  collection  of  chickpea  (Cicer  arietinum L.). Euphytica 2005, 146, 213–222, doi:10.1007/s10681‐005‐9007‐1.  38. Polania, J.; Rao, I.M.; Cajiao, C.; Grajales, M.; Rivera, M.; Velasquez, F.; Raatz, B.; Beebe, S.E. Shoot and Root  Traits Contribute to Drought Resistance in Recombinant Inbred Lines of MD 23–24 × SEA 5 of Common  Bean. Front. Plant Sci. 2017, 8, 296, doi:10.3389/fpls.2017.00296.  39. Sponchiado, B.N.; White, J.W.; Castillo, J.A.; Jones, P.G. Root Growth of Four Common Bean Cultivars in  Relation to Drought Tolerance in Environments with Contrasting Soil Types. Exp. Agric. 1989, 25, 249–257,  doi:10.1017/s0014479700016756.  40. Belachew, K.Y.; Nagel, K.A.; Fiorani, F.; Stoddard, F.L. Diversity in root growth responses to moisture  deficit in young faba bean (Vicia faba L.) plants. PeerJ 2018, 6, e4401, doi:10.7717/peerj.4401.  41. Kumar,  J.;  Basu,  P.S.;  Srivastava,  E.;  Chaturvedi,  S.K.;  Nadarajan,  N.;  Kumar,  S.  Phenotyping  of  traits  imparting drought tolerance in lentil. Crop. Pasture Sci. 2012, 63, 547–554, doi:10.1071/cp12168.  42. Kochian, L.V. Root architecture. J. Integr. Plant Biol. 2016, 58, 190–192, doi:10.1111/jipb.12471.  43. Xu, W.; Cui, K.; Xu, A.; Nie, L.; Huang, J.; Peng, S. Drought stress condition increases root to shoot ratio via  alteration of carbohydrate partitioning and enzymatic activity in rice seedlings. Acta Physiol. Plant. 2015, 37,  9, doi:10.1007/s11738‐014‐1760‐0.  44. Blum, A. Crop responses to drought and the interpretation of adaptation. Plant Growth Regul. 1996, 20, 135– 148, doi:10.1007/bf00024010.  45. Maseda, P.H.; Fernández, R.J. Stay wet or else: Three ways in which plants can adjust hydraulically to their  environment. J. Exp. Bot. 2006, 57, 3963–3977, doi:10.1093/jxb/erl127.  46. Nkomo, G.V.; Sedibe, M.M.; Mofokeng, M.A. Phenotyping cowpea accessions at the seedling stage for  drought tolerance using the pot method. bioRxiv 2020, doi:10.1101/2020.07.10.196915.  47. Sánchez‐Reinoso,  A.D.;  Ligarreto‐Moreno,  G.A.;  Restrepo‐Díaz,  H.  Evaluation  of  drought  indices  to  identify tolerant genotypes in common bean bush (Phaseolus vulgaris L.). J. Integr. Agric. 2020, 19, 99–107,  doi:10.1016/s2095‐3119(19)62620‐1.  48. Shah, T.M.; Imran, M.; Atta, B.M.; Ashraf, M.Y.; Hameed, A.; Waqar, I.; Shafiq, M.; Hussain, K.; Naveed,  M.; Aslam, M.; et al. Selection and screening of drought tolerant high yielding chickpea genotypes based  on  physio‐biochemical  indices  and  multi‐environmental  yield  trials.  BMC  Plant  Biol.  2020,  20,  1–16,  doi:10.1186/s12870‐020‐02381‐9.  49. Arifuzzaman,  M.;  Barman,  S.;  Hayder,  S.;  Azad,  M.A.K.;  Turin,  M.T.S.;  Amzad,  M.A.;  Masuda,  M.S.  Screening  of  bread  wheat  (Triticum  aestivum  L.)  genotypes  under  drought  stress  conditions  using  multivariate analysis. Cereal Res. Commun. 2020, 48, 301–308, doi:10.1007/s42976‐020‐00039‐8.  50. Alidu, M.S. Evaluation of Cowpea Genotypes for Drought Tolerance Using the Pot Screening Approach.  Asian Res. J. Agric. 2018, 10, 1–11, doi:10.9734/arja/2018/45806.  51. Abdou,  R.I.B.Y;  Mensah,  B.;  Addam,  K.S.;  Akromah,  R.  Using  morpho‐physiological  parameters  to  evaluate cowpea varieties for drought tolerance. Int. J. Agric. Sci. Res. 2013, 2, 153–162.  52. Ayala, C.C.; Villadiego, C.C.; Pacheco, C.P.; Tatis, H.A.; Camacho, M.M.E. Growth, biomass distribution,  gas  exchange  and  chlorophyll  fluorescence  in  cowpea  (Vigna  unguiculata  (L.)  Walp.)  under  drought  conditions. Aust. J. Crop. Sci. 2020, 14, 371–381, doi:10.21475/ajcs.20.14.02.p2557.  53. Ravelombola,  W.;  Shi,  A.;  Qin,  J.;  Weng,  Y.;  Bhattarai,  G.;  Zia,  B.;  Zhou,  W.;  Mou,  B.  Investigation  on  Various Aboveground  Traits to  Identify  Drought Tolerance in Cowpea Seedlings.  HortScience 2018,  53,  1757–1765, doi:10.21273/hortsci13278‐18.  54. Gargallo‐Garriga, A.; Sardans, J.; Pérez‐Trujillo, M.; Rivas‐Ubach, A.; Oravec, M.; Vecerova, K.; Urban, O.;  Jentsch,  A.;  Kreyling,  J.;  Beierkuhnlein,  C.;  et  al.  Opposite  metabolic  responses  of  shoots  and  roots  to  drought. Sci. Rep. 2014, 4, 6829, doi:10.1038/srep06829.     Agronomy 2020, 10, 1604  20  of  20  55. Hamidou, F.; Zombré, G.; Braconnier, S. Physiological and Biochemical Responses of Cowpea Genotypes  to  Water  Stress  Under  Glasshouse  and  Field  Conditions.  J.  Agron.  Crop.  Sci.  2007,  193,  229–237,  doi:10.1111/j.1439‐037x.2007.00253.x.  56. Ogbonnaya,  C.I.;  Sarr,  B.;  Brou,  C.;  Diouf,  O.;  Diop,  N.N.;  Roy‐Macauley,  H.  Selection  of  Cowpea  Genotypes  in  Hydroponics,  Pots,  and  Field  for  Drought  Tolerance.  Crop.  Sci.  2003,  43,  1114–1120,  doi:10.2135/cropsci2003.1114.  Publisherʹs Note: MDPI stays neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional  affiliations.  © 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access  article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution  (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 

Journal

AgronomyMultidisciplinary Digital Publishing Institute

Published: Oct 20, 2020

There are no references for this article.