Get 20M+ Full-Text Papers For Less Than $1.50/day. Start a 14-Day Trial for You or Your Team.

Learn More →

Reactive Oxygen Species (ROS) Metabolism and Nitric Oxide (NO) Content in Roots and Shoots of Rice (Oryza sativa L.) Plants under Arsenic-Induced Stress

Reactive Oxygen Species (ROS) Metabolism and Nitric Oxide (NO) Content in Roots and Shoots of... Article  Reactive Oxygen Species (ROS) Metabolism and  Nitric Oxide (NO) Content in Roots and Shoots of  Rice (Oryza sativa L.) Plants under   Arsenic‐Induced Stress  1 2 2 2,   Ernestina Solórzano  , Francisco J. Corpas  , Salvador González‐Gordo   and José M. Palma  *   Departmento de Medio Ambiente, Instituto de Ciencias y Tecnologías Aplicadas (INSTEC), Quinta de los  Molinos, Ave. Salvador Allende, Plaza de la Revolución, La Habana 1110, Cuba; esolorza@instec.cu    Group of Antioxidants, Free Radicals and Nitric Oxide in Biotechnology, Food and Agriculture,  Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology of Plants, Estación Experimental del Zaidín,  CSIC, Apartado 419, E‐18080 Granada, Spain; javier.corpas@eez.csic.es (F.J.C.);  salvador.gonzalez@eez.csic.es (S.G.‐G.)  *  Correspondence: josemanuel.palma@eez.csic.es; Tel: +34‐958‐181‐600  Received: 25 May 2020; Accepted: 12 July 2020; Published: 14 July 2020  Abstract: Arsenic (As) is a highly toxic metalloid for all forms of life including plants. Rice is the  main food source for different countries worldwide, although it can take up high amounts of As in  comparison with other crops, showing toxic profiles such as decreases in plant growth and yield.  The induction of oxidative stress is the main process underlying arsenic toxicity in plants, including  rice, due to an alteration of the reactive oxygen species (ROS) metabolism. The aim of this work was  to gain better knowledge on how the ROS metabolism and its interaction with nitric oxide (NO)  operate under As stress conditions in rice plants. Thus, physiological and ROS‐related biochemical  parameters in roots and shoots from rice (Oryza sativa L.) were studied under 50 μM arsenate (AsV)  stress, and the involvement of the main antioxidative systems and NO in the response of plants to  those conditions was investigated. A decrease of 51% in root length and 27% in plant biomass was  observed with 50 μM AsV treatment, as compared to control plants. The results of the activity of  superoxide dismutase (SOD) isozymes, catalase, peroxidase (POD: total and isoenzymatic), and the  enzymes of the ascorbate–glutathione cycle, besides the ascorbate and glutathione contents, showed  that As accumulation provoked an overall significant increase of most of them, but with different  profiles  depending  on  the  plant  organ,  either  root  or  shoot.  Among  the  seven  identified  POD  isozymes, the induction of the POD‐3 in shoots under As stress could help to maintain the hydrogen  peroxide  (H2O2)  redox  homeostasis  and  compensate  the  loss  of  the  ascorbate  peroxidase  (APX)  activity in both roots and shoots. Lipid peroxidation was slightly increased in roots and shoots from  As‐treated plants. The H2O2 and NO contents were enhanced in roots and shoots against arsenic  stress. In spite of the increase of most antioxidative systems, a mild oxidative stress situation appears  to be consolidated overall, since the growth parameters and those from the oxidative damage could  not  be  totally  counteracted.  In  these  conditions,  the  higher  levels  of  H2O2  and  NO  suggest  that  signaling events are simultaneously occurring in the whole plant.  Keywords:  antioxidants;  ascorbate;  glutathione;  hydrogen  peroxide;  isoenzyme;  nitric  oxide;  superoxide dismutase  Agronomy 2020, 10, 1014; doi:10.3390/agronomy10071014  www.mdpi.com/journal/agronomy  Agronomy 2020, 10, 1014  2  of  19  1. Introduction  Arsenic (As) is one of the major environmental pollutants distributed worldwide, although it  concentrates  especially  in  certain  areas,  since  this  metalloid  is  a  byproduct  of  industrial  and  agricultural  (through  the  use  of  fertilizers)  activities.  Arsenic  is  highly  toxic  for  all  forms  of  life  including plants, and can affect all links in the trophic chain [1–8]. Consequently, As‐contaminated  groundwater and food are serious health risks, because As may enter organisms by different ways  [1]. In animals, As interrupts the mitochondrial ATP production at different levels, but it also disrupts  the  cellular  electrolytic  function  interfering  on the  voltage‐gated potassium  channels (VGKCs).  It  results in neurological imbalances, high blood pressure, cardiovascular episodes, anemia and even  death [9–12]. In plants, As provokes developmental negative effects [13], although plant sensitivity  can significantly vary among species and among cultivars within the same species.  Plants undergo contamination by arsenic due to the anionic forms of the metalloid, both arsenate  (AsV) and arsenite (AsIII). This latter form reacts with protein sulfhydryl (‐SH) groups triggering  cellular dysfunction which can lead to cell death. AsV is an analog to phosphate, one of the most  important macronutrients in plants, thus competing through phosphate transporters and nodulin 26‐ like intrinsic channels in the root uptake mechanism [14]. Once in the cytoplasm it can disrupt the  cell  metabolism  by  replacing  phosphate  in  ATP,  thus  giving  rise  to  the  unstable  form  ADP/As  (adenosine‐5′‐diphosphate/arsenate). In root cells, AsV is reduced to AsIII by the arsenate reductase,  which is a more toxic species. This reaction is accompanied by the concomitant conversion of reduced  glutathione (GSH) to the oxidized form (GSSG) of this tripeptide. AsIII can be detoxified through  soluble thiols such as the plant’s own GSH, but also via phytochelatins (PCs), small polypeptides rich  in GSH [4]. Arsenite can also be mobilized for its vacuolar sequestration by virtue of the activity of  ABC (ATP‐binding cassette) transporters [15,16].  In plants, all tissues are prone to be adversely affected by arsenic and diverse approaches have  been developed to accomplish this research. Although much of the knowledge on the biochemical  and molecular mechanisms underlying As toxicity in plant cells has been obtained from the use of  plant models such as Arabidopsis thaliana [17–25], the transport, metabolism, accumulation, toxicity  and detoxification of As have been thoroughly studied in many species under different perspectives  including the existence of hyper‐accumulation mechanisms, because it occurs in some plant species,  as  well as the  synthesis  of  phytochelatins, and  the metabolism  of  reactive  oxygen  species (ROS),  among  others  [1,4,17,20–23,26,27].  In  fact,  the  induction  of  oxidative  stress  is  the  main  process  underlying arsenic toxicity in plants. Accordingly, plants basically respond to oxidative stress by  increasing  the  production  of  antioxidant  enzymes  [4,27–31].  Thus,  the  activity  of  catalase  (CAT),  superoxide  dismutase  (SOD),  ascorbate  peroxidase  (APX),  and  glutathione  reductase  (GR)  from  rapeseed  (Brassica  napus)  has  been  reported  to  follow  a  positive  correlation  with  increasing  As  concentrations [30] and, similarly, a correlation between arsenic accumulation in the different organs  and the antioxidative response of garlic (Allium sativum) was found [4,27,31]. On the contrary, it was  also recently reported that As inhibits CAT activity in Arabidopsis thaliana.  Commonly, agronomic species with a low tolerance against arsenic show toxic profiles such as  a decrease in plant growth and crop yield. Among the main agronomic species consumed worldwide,  rice (Oryza sativa L.) is one of the most studied under As stress conditions [28,32–40]. Rice is the main  food source for many countries and it is well known that this species is susceptible to accumulating  moderate/high As concentrations in whole plants and grains [33,34,38]. Thus, rice usually takes up  arsenic in the form of methylated arsenic (o‐As) and inorganic arsenic species (i‐As) [34,36]. This As  uptake  notably  influences  the  translocation  of  nutrients  into  rice  plants  and,  consequently,  the  nutritional mineral composition in countries where this cereal is the basis for the human diet [32].  Diverse  effects  exerted  by  the  metalloid  in  rice  plants  have  been  reported.  A  common  response  consisting of the synthesis of PCs to complex arsenic has been described, as well as a thiolic metabolite  synthesis coordinated and proportional to the tolerance to such metalloid [29,32,35,36]. On the other  hand,  early  studies  with  arsenic  treatment  in  this  species  showed  that  an  accumulation  of  As  occurred,  accompanied  by  an  up‐regulation  of  SOD,  APX,  GR,  and  peroxidase  along  with  an  increased malondialdehyde (MDA) content [28]. This redox pattern, which matches with oxidative  Agronomy 2020, 10, 1014  3  of  19  stress conditions, was later reported but was also associated with imbalances of the profiles of certain  amino acids such as proline, cysteine, glycine, glutamic acid and methionine, the content of which  was higher in rice varieties, showing a higher tolerance to As [29,37]. All this evidence associates As  to oxidative stress, although knowledge gaps still remain on some aspects, such as the whole redox  metabolic picture displayed in both roots and aerials parts, and what the interconnection is regarding  the ROS/antioxidant metabolism with some modulating molecules such as nitric oxide (NO). In fact,  NO is a gas radical which, together with its derived reactive nitrogen species (RNS), display powerful  regulatory functions in many physiological processes and under stress conditions in plants [41,42].  The  aim  of  this  work  was  to  gain  better  knowledge  on  how  the  ROS  metabolism  and  its  interaction with NO operate under As stress conditions in rice plants. Thus, physiological and ROS‐ related biochemical parameters in roots and shoots from rice (Oryza sativa L.) were studied under 50  μM arsenate (AsV) stress, and the involvement of the main antioxidative systems and NO in the  response  of  plants  to  those  conditions  was  investigated.  The  pattern  of  two  important  signaling  molecules such as H2O2 and NO, along with that of MDA, suggests that As at 50 μM provokes a  situation of mild oxidative stress where the interaction between H2O2 and NO might be responsible  for the responses issued by plants.  2. Materials and Methods  2.1. Plant Material and Growth Conditions  Rice (Oryza sativa L) seeds were planted and grown in vermiculite for 14 d under controlled  conditions. Healthy and vigorous seedlings (n = 36) were selected and transplanted to hydroponic  culture  in  4  L  plastic  pots  in  aerated  full  nutrient  media  under  optimal  conditions  in  a  growth  chamber. After 14 d, nutrient solution was added with 0, 10, 25, 50,  100, and 200 μM potassium  dihydrogen arsenate (KH2AsO4) which corresponds to the AsV form. The AsV form was used in our  study  since  AsIII  is  predominant  under  anaerobic  flooded  conditions,  whereas  AsV  is  the  most  appropriate  to  improve  crop  yield  under  P  fertilization  [32].  Our  experimental  conditions,  with  aerated full nutrient media, including P, fit better with the use of AsV. Then, plants were grown for  −2 −1 12 d at 22/18 °C, day/night temperatures, a photoperiod of 16 h, and 100–120 μmol m s  irradiance  (Figure 1). The composition of the nutrient solution was: 1 mM Ca(NO3)2,1 mM KH2PO4, 1 mM KNO3,  1 mM MgSO4, 50 μM Na–Fe–EDTA, 46 μM H3BO3, 10 μM MnSO4, 0.77 μM ZnSO4, 0.32 μM CuSO4,  0.58 μM Na2MoO4, 0.01 μM CoCl2 and pH adjusted to 6.0 with KOH. After the growth period, roots  and  leaves  from  the  control  and  AsV‐treated  plants  were  harvested  and  used  for  analytical  and  biochemical assays. Length and fresh weight were measured in roots, shoots and whole plants from  all treatments.  Figure 1. Experimental design of the arsenate effect on 26‐d‐old rice seedlings grown in hydroponic  solutions supplemented the last 12 days with 50 μM arsenate (AsV).  Agronomy 2020, 10, 1014  4  of  19  2.2. Arsenic and Main Nutrient Contents  Arsenic‐treated and untreated full plants were washed with Milli‐Q water containing 0.1 mM  ethylene  tetraacetic  acid  (EDTA).  Then,  roots  and  shoots  were  separated,  dried  for  8  h  at  80  °C,  pulverized, and digested for 90 min (total time) in a HNO3:HClO4 (2:1; v/v) solution. Mineral arsenic,  and  some  macro‐  (K,  P,  S),  and  micro‐nutrients  (Fe,  Cu  and  Mn)  were  analyzed  by  inductively  coupled plasma spectrometry using a Varian720‐ES ICP‐OES spectrometer (Varian ICP 720‐ES, Santa  Clara, California, USA). The root to shoot translocation factor (TFroot to shoot) was considered as the  ability of plants to translocate As from roots to the aerial parts and was estimated through the formula  TFroot to shoot = [As shoot]/[As root] [4].  2.3. Preparation of Crude Extracts for Enzyme and Lipid Peroxidation Assays  Plant material was frozen under liquid N2 and pulverized in a mortar with a pestle. The powder  was suspended in a homogenizing medium composed of 50 mM Tris‐HCl, pH 7.8, 0.1 mM EDTA,  10% (v/v) glycerol, 0.2% (v/v) Triton X‐100, and 5 mM dithiothreitol (DTT). For the determination of  APX  activity,  2  mM  ascorbate  was  added  to  the  homogenizing  medium  to  preserve  the  enzyme  activity [43]. Homogenates were centrifuged 25 min at 15,000 g, 4 °C, and supernatants were used  immediately for assays.  2.4. Enzyme Activity Assays  Catalase (EC 1.11.1.6) activity was determined at 240 nm by following the breakdown of H2O2  [44].  Ascorbate  peroxidase  (APX;  EC  1.11.1.11)  was  plotted  by  monitoring  the  initial  ascorbate  oxidation  by  H2O2  at  290  nm  [45].  Monodehydroascorbate  reductase  (MDAR;  EC  1.6.5.4)  was  measured by assaying the monodehydroascorbate‐dependent NADH oxidation. In these assays, the  monodehydroascorbate was generated through the ascorbate/ascorbate oxidase system, as reported  earlier [46]. The rate of monodehydroascorbate‐independent NADH oxidation (without ascorbate  oxidase and ascorbate) was subtracted from the monodehydroascorbate‐dependent reaction. GR (EC  1.6.4.2) was analyzed by recording the NADPH oxidation coupled to the reduction of GSSG to the  GSH form [47]. The GR reaction rate in the assays was corrected for the very small, nonenzymatic  oxidation of NADPH by GSSG. Guaiacol peroxidase (G‐POD; EC 1.11.1.7) activity was determined  by monitoring the guaiacol oxidation at 470 nm [48].  For  the  detection  of  SOD  (EC  1.15.1.1)  and  peroxidase  (POD)  isozymes,  nondenaturing  polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and specific staining methods were followed. Thus, SOD  isozymes  were  separated  on  10%  acrylamide  gels  and  visualized  in‐gel  by  the  photochemical  nitroblue  tetrazolium  (NBT)  reduction  method  [49].  Acromatic  bands  appeared  over  a  blue  background. To identify the different SOD isozymes, before staining preincubation of gels in the  presence of specific inhibitors, either 5 mM KCN or 5 mM H2O2, was carried out. Cyanide inhibits  copper zinc‐containing SODs (CuZn‐SODs), H2O2 inactivates CuZn‐SODs and iron‐containing SODs  (Fe‐SODs), and manganese‐containing SODs (Mn‐SODs) are resistant to both chemicals [50,51]. For  POD  isozymes,  8%  acrylamide  gels  were  prepared  and  the  in‐gel  activity  was  developed  by  immersing  gels  for  20  min  in  a  solution  (pH  5.5)  containing  0.1  M  sodium  acetate,  1  mM  3,3‐ diaminobenzidine (DAB) and 0.03% (v/v) H2O2 [52]. Band intensity of SOD and POD isozymes was  quantified using ImageJ 1.45 software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA).  Protein  concentration  was  determined  by  the  method  of  Bradford  [53],  with  the  Bio‐Rad  (Hercules, California, USA) protein assay solution and bovine serum albumin as standard.  2.5. Detection and Quantification of Ascorbate, GSH and GSSG by Liquid Chromatography‐Electrospray  Mass Spectrometry (LC‐ES/MS)  Rice roots and shoots were ground under liquid N2 with the use of a mortar and a pestle. Then,  0.4 g from each powdered organ were suspended into 1 mL of 0.1 M HCl and centrifuged at 15,000g  for 20 min at 4 °C. Supernatants were filtered through 0.22 μm polyvinylidene fluoride filters and  immediately  analyzed,  with  all  procedures  performed  at  4  °C  and  protected  from  light  to  avoid  Agronomy 2020, 10, 1014  5  of  19  potential  degradation  of  the  analytes.  All  samples  were  analyzed  by  liquid  chromatography– electrospray/mass  spectrometry  (LC‐ES/MS) using an Allience 2695  HPLC  system  connected to a  Micromass Quattro micro API triple quadrupole mass spectrometer, both obtained from the Waters  Corporation (Milford, Massachusetts, USA). HPLC was carried out using an Atlantis  T3 3 μm 2.1 ×  100 mm Column obtained from the Waters Corporation. For the instrument control, data collection,  analysis and management, the MassLynx 4.1 software (Waters Corporation (Milford, Massachusetts,  USA)  package  was  used.  This  method  allowed  for  simultaneous  detection  and  quantification  of  ascorbate,  GSH,  and  GSSG  [54,55].  The  concentration  of  analytes  was  calculated  using  external  −1 standards and expressed as nmol g  of fresh weight (FW).  2.6. Other Assays  Lipid  peroxidation  was  estimated  by  measuring  the  concentration  of  MDA  through  the  thiobarbituric acid reacting substances (TBARS) method [56]. Nitric oxide (NO) was determined by  a  spectrofluorometric  assay  using  10 μM  4,5‐diaminofluorescein (4,5‐diaminofluorescein,  DAF‐2),  (Calbiochem , EMD Chemicals, San Diego, California, USA) as fluorescence probe and excitation and  emission  wavelengths  of  485  and  515  nm,  respectively  [57].  H2O2  was  detected  and  quantified  according to a peroxidase‐coupled assay using 4‐aminoantipyrine and phenol as donor substrates  [58].  2.7. Statistical Analysis  All data are means from three to five sets of independent experiments with three repetitions  each. In Figures 2–4 one‐way Anova was used for comparisons between means using the program  Statgraphics Centurion (Statgraphics.Net, Madrid, Spain). In Figures 5, 7 and 8, t‐Student was used  to  compare  data  from  As‐treated  plants  with  control  ones.  Asterisks  were  used  to  distinguish  significance levels, either p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) or p < 0.001 (***).  3. Results  As  an  approach  to  investigate  the  effect  of  AsV  on  the  ROS  metabolism  in  rice  plants,  a  preliminary  analysis  of  the  growth  parameters  under  different  As  (form  V)  concentrations  was  carried out. Figure 2A shows a representative image of the appearance of 26‐d‐old rice plants in the  six treatments followed in this work (0–200 μM). According to the visual analysis, a slight chlorosis  seems to be promoted by arsenic. As observed in Figure 2, As provoked a diminution of growth  parameters, from the lowest concentration used in this study (10 μM). This effect was clearer from  data on fresh weight (Figure 2B) than those on length (Figure 2C). Thus, the observed changes in  growth were basically due to the drastic effect exerted on shoot biomass and length, whereas the  roots were less affected.  Agronomy 2020, 10, 1014  6  of  19  Figure  2.  Effect  of  arsenate  (AsV)  on  26‐d‐old  rice  seedlings  grown  in  hydroponic  solutions  supplemented the last 12 days with different AsV concentrations. (A) Representative image of rice  seedlings at all As concentrations used in this work. (B) Plant biomass (g/plant). (C) Plant length  (cm/plant). Data are means ± SEM of at least three independent experiments. Different letters over the  columns for each organ (either whole plant, shoot or root) indicate that differences with respect to  control (0 μM AsV) values were statistically significant at p < 0.05.  The content of some macro‐ and micro‐nutrients was also analyzed. Thus, Figure 3 (panels A to  F) shows the K, P, S, Fe, Cu and Mn contents in roots and leaves of 26‐d‐old rice seedlings grown  under hydroponic conditions and exposed to 0, 10, 25, 50, 100 and 200 μM AsV during the last 12  days of the experiment. In roots, K content followed a progressive decrease as the AsV concentration  was  enhanced,  reaching  the  lowest  K  content  (55%)  at  an  AsV  concentration  of  200 μM.  This  micronutrient was unaffected in shoots (Figure 3A). Figure 3B shows the P content in rice roots and  shoots exposed to AsV, with values in roots lowering around 40% at AsV concentrations of 100–200  μM.  However, in the shoots the P content  was also  unaffected. Regarding  S content both organs  showed a progressive significant enhancement from AsV 25 μM, being 1.8‐fold higher in roots and  1.7‐fold in shoots at 200 μM As, compared to untreated plants (Figure 3C). Figure 3D illustrates the  Fe content which significantly increased from AsV 25 μM in roots, being 3.2‐fold higher in AsV of  200 μM. However, in shoots the Fe content was unaffected by AsV. Cu content decreased in both  organs but most drastically in roots (2.9‐fold lower at 200 μM AsV), rather than in shoots (2.0‐fold at  maximum AsV concentration) (Figure 3E). Figure 3F shows the Mn content, which had an irregular  and opposite behavior in both organs, since it only increased in roots at 200 μM AsV (1.8‐fold) but  lowered in shoots from 10 μM AsV up to 3.7 times.  Agronomy 2020, 10, 1014  7  of  19  Figure 3. Content of K, P, S, Fe, Cu and Mn in roots and shoots of 26‐d‐old rice seedlings grown in  hydroponic  solutions  supplemented  the  last  12  days  with  different  AsV  concentrations.  (A)  Potassium. (B) Phosphorus. (C) Sulfur (D) Iron. (F) Copper. (E) Manganese. Data are means ± SEM of  at least three independent experiments. Different letters over the columns for each organ (either shoot  or  root)  indicate  that  differences  with  respect  to  control  (0 μM  AsV)  values  were  statistically  significant at p < 0.05.  A global analysis of the above parameters on growth and mineral contents led us to set 50 μM  as the threshold concentration. The analysis of the As content in both roots and shoots at all assayed  As  concentrations  showed  that  the  metalloid  was  mostly  concentrated  in  roots,  although  at  the  highest concentration (200 μM), shoots displayed a fifth of the values obtained in roots (Figure 4). As  shown in Table 1, the TF indicated that As was transported from roots to shoots in parallel with the  As increasing concentrations in the nutrient solutions. Again, considering the data from both parts of  plants,  50 μM  AsV  was  the  level  from  which  this  parameter  displayed  the  clearest  changes.  Accordingly, this concentration of 50 μM was set to achieve further study of the effect of As on the  ROS  metabolism  of  rice.  For  that  purpose,  enzymatic  and  nonenzymatic  antioxidants  were  investigated.  Agronomy 2020, 10, 1014  8  of  19  Figure 4. Arsenic content in roots and shoots of 26‐d‐old rice seedlings grown in hydroponic solutions  supplemented the last 12 days with different AsV concentrations. Data are means ± SEM of at least  three independent experiments. DW, dry weight. Different letters over the columns for each organ  (either  shoot  or  root)  indicate  that  differences  with  respect  to  control  (0 μM  AsV)  values  were  statistically significant at p < 0.05.  Table 1. Translocation factor (TFroot to shoot) in 26‐d‐old rice seedlings grown in hydroponic solutions  supplemented with different AsV concentrations during the last 12 days. For the estimation of TF, the  following formula was applied, TFroot to shoot = [As shoot]/[As root].  Treatment (μM AsV) TF root to shoot 0 - 10 0.047 25 0.056 50 0.085 100 0.096 200 0.197 A battery of antioxidative enzymes, including catalase, those from the ascorbate–glutathione  cycle (AGC) APX, MDAR and GR, peroxidases and SOD was evaluated. As depicted in Figure 5A,  catalase  increased  in  both  roots  and  shoots  as  a  consequence  of  the  treatment  with  50 μM  AsV.  Interestingly, the other important H2O2‐scavenging enzyme in plant cells, the APX, behaved in an  opposite way, lowering its activity after the As treatment (Figure 5B). The other two enzymes of the  AGC, MDAR and GR, which use NAD(P)H and NADPH, respectively, to carry out their catalytic  reaction were only enhanced significantly in the aerial parts (Figure 5C,D). Guaiacol peroxidase (G‐ POD), another enzyme that consumes H2O2, increased significantly in roots, and no changes were  detected in shoots (Figure 5E)  Agronomy 2020, 10, 1014  9  of  19  Figure 5. Activity of diverse antioxidant enzymes in roots and shoots of 26‐d‐old rice seedlings grown  in hydroponic solutions supplemented the last 12 days without (control) and with 50 μM AsV. (A)  Catalase.  (B)  APX,  ascorbate  peroxidase.  (C)  MDAR,  monodehydroascorbate  reductase.  (D)  GR,  glutathione  reductase.  (E)  G‐POD,  guaiacol  peroxidase.  Data  are  means  ±  SEM  of  at  least  three  independent  experiments.  Asterisks  indicate  that  differences  with  respect  to  control  (0 μM  AsV)  values were statistically significant at p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***).  The isoenzyme pattern of SODs and peroxidases were achieved by nondenaturing PAGE and  the respective abundance of each isoenzyme was quantified by using the image analyzer software  ImageJ  (Figure  6).  Thus,  it  was  found  that  the  SOD  system  consisted  of  four  isoenzymes,  which  according  to  their  sensibility  to  the  specific  inhibitors  cyanide  and  H2O2  and  the  increasing  electrophoretic mobilities, were designated as  Mn‐SOD, Fe‐SOD, CuZn‐SOD I,  CuZn‐SOD II and  CuZn‐SOD III (Figure 6A). In control plants, the most abundant isozymes in the roots were Mn‐SOD  and CuZn‐SOD I, whereas in shoots both CuZn‐SOD I and CuZn‐SOD II showed the highest activities  and  the  Fe‐SOD  could  not  be  nearly  detected.  CuZn‐SOD  III  could  only  be  found  in  shoots.  No  significant changes on the SOD isoenzyme profiles were detected as the effect of As, excepting slight  decreases  of  Mn‐SOD  and  Fe‐SOD  in  roots  and  of  CuZn‐SOD  I  in  shoots,  along  with  a  little  enhancement of CuZn‐SOD III in shoots (Figure 6A). With respect to peroxidases, up to 7 isoenzymes  could  be  detected  after  specific  DAB‐staining  of  gels  which  were  designated  POD  1—POD  7  depending of their increasing electrophoretic mobilities (Figure 6B). POD 1, POD 2 and POD 4 were  present in roots, whereas the shoots contained all isozymes excepting POD 2. Neither qualitative nor  quantitative changes promoted by As treatment were observed in the isozyme pattern of roots. On  Agronomy 2020, 10, 1014  10  of  19  the contrary, in shoots POD 3 was induced by As while POD 1, 4, 6 and 7 were down‐regulated by  effect of the metalloid (Figure 6B).  Figure 6. Superoxide (SOD) and peroxidase (POD) isoenzyme activity in roots and shoots of 26‐d‐old  rice seedlings grown in hydroponic solutions supplemented the last 12 days without (control) and  with 50 μM AsV. (A) SOD. (B) POD. Isoenzymes were separated by nondenaturing PAGE in 10%  (SOD) and 8% (POD) acrylamide gels. Then, the respective in‐gel activity was detected by the NBT  reduction  method  and  the  DAB  oxidation  method,  respectively.  Isozymes  from  both  enzymatic  systems are depicted on the left of each panel. Similar protein amount (80 μg) per lane was loaded in  each  gel.  For  each  isoenzyme  profile,  a  representative  picture,  from  at  least  three  experiments,  is  shown. Relative quantification of band intensities was performed using the image analyzer software  ImageJ.  On the other hand, as indexes of the antioxidative capacity of both organs under As treatment,  two  of  the  most  powerful  and  abundant  cell  antioxidants  were  determined,  ascorbate,  and  glutathione  (reduced and oxidized  form).  Globally,  all these  compounds  were  more abundant in  shoots than in roots (Figure 7). The ascorbate content was enhanced by As in both organs (Figure 7A).  With  respect  to  GSH,  the  treatment  with  As  provoked  an  increase  in  the  aerial  part,  whilst  no  variation was observed in roots (Figure 7B). The behavior of GSSG was opposite in both roots and  shoots as a consequence of the metalloid effect. Thus, while As promoted a significant rise in roots,  this parameter lowered in shoots from As‐treated plants (Figure 7C). The redox reduced/oxidized  (GSH/GSSG) state of glutathione was determined. In roots, this ratio lowered from 51.0 under control   from 12.6 (control) to 30.8  conditions to 12.1 in As‐treated plants. Regarding shoots, this ratio rose (As).  Agronomy 2020, 10, 1014  11  of  19  Figure 7. Content of ascorbate and glutathione (reduced and oxidized) in roots and shoots of 26‐d‐ old rice seedlings grown in hydroponic solutions supplemented the last 12 days without (control) and  with 50 μM AsV. (A) Ascorbate. (B) Reduced glutathione (GSH). (C) Oxidized glutathione (GSSG).  Data  represent  the  mean  ±  SEM  of  at  least  three  different  experiments.  Asterisks  indicate  that  differences with respect to control (0 μM AsV) values were statistically significant at p < 0.05 (*), p <  0.01 (**) and p < 0.001 (***).  The content of two important signaling molecules (H2O2 and NO) in plant physiology were also  determined in these experiments. In all cases both species increased significantly due to the metalloid  (Figure  8A,B,  respectively).  Finally,  lipid  peroxidation,  a  known  index  of  oxidative  stress,  was  analyzed. It was shown that the formation of MDA species increased moderately, but significantly,  in both roots and shoots of plants subjected to As treatment (Figure 8C).  Figure 8. Levels of hydrogen peroxide, lipid peroxidation and nitric oxide in roots and shoots of 26‐ d‐old rice seedlings grown in hydroponic solutions supplemented the last 12 days without (control)  and with 50 μM AsV. (A) Hydrogen peroxide (H2O2) content. (B) Nitric oxide (NO) content. (C) Lipid  peroxidation level. Data represent the mean ± SEM of at least three different experiments. Asterisks  indicate that differences with respect to control (0 μM AsV) values were statistically significant at p <  0.05 (*), p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***).  4. Discussion  According to the analysis of the mineral content carried out in this work, it is remarkable that  the  root  was  the  organ  that  underwent  the  most  significant  differences  under  AsV‐stress,  with  reductions in the content of K, P and Cu whereas S, Fe and Mn increased. However, the content of  these minerals in shoots was less affected, with the rise of S content and the reduced content of Cu  and Mn being the most remarkable.  It has been thoroughly  reported that arsenic (As), either as AsIII  or AsV, provokes negative  effects in plant development with significant alterations at cellular, biochemical and molecular levels.  Thus, the most consensual mechanism by which As affects plant metabolism implies oxidative stress  events  [4,5,13,14,21–23,25,59,60].  Nevertheless,  the  sensitivity  to  and  the  response  against  As  can  significantly differ among plant species, among cultivars within the same species, between roots and  Agronomy 2020, 10, 1014  12  of  19  aerial parts in the same plant, but they also may depend on the concentration and the active form of  the  metalloid  (AsIII  or  AsV)  and  the  geographical  locations  [14,27,34,36,39,61–63].  Due  to  the  relevance at agronomical and economical levels and its wide distribution in some geographical areas,  rice (Oryza sativa) has been the major crop species where these studies have been achieved, with the  coincidence that rice grains, which are the nutritional basis for many countries worldwide, are able  to accumulate this metalloid, thus favoring the risk to transmit As to the human population and the  rest  of  the  food  chain  [64].  Up  until  today,  a  diversity  of  effects  of  As  on  the  physiology  and  metabolism of rice plants has been reported, but some gaps in the intimate mechanism of As toxicity  in  this  crop  are  still  unknown  due  to  the  diversity  of  interactions  with  metabolic  and  signaling  processes.  To perform our study, we initially used a wide range of arsenate concentrations (10–200 μM  AsV) to set the potential threshold at which the metalloid starts provoking significant effects. Arsenic  promoted a decrease in growth parameters just from the lowest concentration used, although it was  more significantly evident in fresh weight. This pattern agrees with previously reported data in this  plant  species  [28,31,37,62,65].  Additionally,  the  mineral  contents  of  K,  P,  S,  Fe,  Cu  and  Mn  was  analyzed  in  rice  seedlings  under  AsV  stress.  It  is  remarkable  that  the  root  was  the  organ  that  underwent the most prominent differences, with significant reductions in the content of K, P and Cu  whereas S, Fe and Mn increased due to As treatment. However, the content of these minerals in shoots  was less affected, with the increase of S content and the reduced content of Cu and Mn being the most  remarkable.  Taking  into  account  the  growth  parameters,  50 μM  AsV  was  considered  as  the  threshold  concentration to achieve our further research. It was also found that from this As concentration and  above, the metalloid was translocated to the aerial parts more efficiently, so it indicates that this was  the best concentration to follow the effects in the oxidative metabolism in shoots. The TFroot to shoot  values obtained in this work are mostly in the range reported before for rice (0.05‐1.43) [36], but above  most TFroot to shoot displayed by other species such as lettuce (Lactuca sativa), romaine lettuce (Lactuca  sativa var. longifolia), garlic (Allium sativum), water spinach (Ipomea aquatica), celery (Apium graveolens)  or pea (Pisum sativum), which showed values of 0.02–0.17 [4,66]. Although the obtained values in rice  indicate that most of the metalloid remains in the roots, the comparison with other species with lower  TFroot to shoot values might explain why As is accumulated in reproductive tissues (grains) which are  part of the aerial organs in this crop.  As in other plant species investigated so far, the main symptom in rice plants as a consequence  of high As concentrations is the induction of oxidative stress characterized by an alteration of the  antioxidative systems and increases of lipid peroxidation levels. This assertion is based on results  obtained from a diversity of experimental designs where As has been used as AsIII or AsV at different  concentrations and for various experimental lengths [5,28,29,31,33,37,60,62,65]. Our work establishes  a whole picture on how the main antioxidant systems (both enzymatic and nonenzymatic) respond  to a threshold (sub‐toxic) As concentration at both root and aerial parts after 12 d treatment.  Globally, roots and shoots displayed parallel activity patterns in all antioxidative enzymes. The  H2O2‐scavenging  enzymes  catalase  (CAT)  and  guaiacol  peroxidase  (G‐POD)  increased  in  both  organs, but with different profiles. Thus, whereas CAT showed greater augmentation in shoots, G‐ POD did in roots. Catalase is the main enzyme responsible for removing H2O2 in plants, and is mainly  relevant in photosynthetic tissues where, due to its high KM, in the mM range, it is able to decompose  important amounts of the ROS [67–71]. Regarding peroxidase, the pattern observed in both organs  by  determining the activity  spectrophotometrically differed  from the  isoenzyme  profile  observed  after nondenaturing PAGE. Thus, no changes were found in roots after As treatment, whereas the  metalloid greatly induced isozyme POD 3 in shoots. This points towards an important role of this  isozyme,  and  more  research  is  necessary  to  address  the  full  identification  and  nature  of  POD  3.  Recently, it has been reported that OsPRX38, a class HI peroxidase is upregulated under As stress in  rice.  This  isozyme  has  been  overexpressed  in  Arabidopsis  thaliana  enhancing  the  tolerance  of  the  mutants  to  As  and  this  was  accompanied  by  increased  SOD,  POD  and  glutathione‐S‐transferase  activities and lower H2O2 and malondialdehyde contents [72]. The POD isoenzyme pattern reported  Agronomy 2020, 10, 1014  13  of  19  here  differs  from  that  reported  earlier  where  only  four  less  defined  isozymes  were  detected.  Moreover, distinct AsV concentrations (100 and 500 μM) were used in such work [28].  Interestingly, APX, the enzyme which finely tunes the H2O2 level in cooperation with catalase  and peroxidases in plant cells, displayed an opposite behavior to these last enzymes in both organs,  with down regulated activity promoted by arsenic. It has been reported that rice contains a total of  eight APX isozymes present in the different subcellular compartments [73]. In this context, it has been  shown in cytosolic APX1 and APX2 double knockdown rice plants that abiotic stress promotes an  induction of POD activity to compensate the loss of APX [74]. This mechanism would allow keeping  the  appropriate  H2O2  levels  for  both  signaling  and  oxidative  protection.  This  trend  is  in  good  agreement with the observed increase of POD 3 activity in shoots under As stress. The profile of APX  activity  depicted  in  this  work  is  also  contrary  to  the  upregulating  effect  of  the  metalloid  on  the  ascorbate content. This antioxidant was greatly increased by As and this was more visible in shoots.  This opposite evolution of ascorbate and APX indicates that the AGC is possibly uncoupled and not  properly functioning due to the As. This eventuality is supported by the fact that the two other AGC  determined in this work (MDAR and GR) are upregulated by As in shoots. It could be explained in  two ways. On the one hand, both MDAR and GR might be implicated in the regeneration of ascorbate  once it has been oxidized by direct action over ROS, without the participation of the APX; on the  other hand, the GR activity may work independently to provide reduced GSH for other purposes  such as the synthesis of phytochelatins (PCs). The profile of the glutathione levels supports this last  assumption since the reduced form (GSH) shares the same tendency displayed by the GR activity.  The induction of the synthesis of PCs is a common event which is triggered by arsenic as it has been  demonstrated in several plant species [4,5,75–77] and also in rice [29,33,35,36]. Very recently, it has  been also reported that O. sativa L. cv. Dasan plants cultivated for 14 d in the presence of 15 μM AsIII  and sprayed with GSH reduced the oxidative stress promoted by arsenic, improved the antioxidant  defense systems through maintaining the redox homeostasis and increased the ascorbate and GSH  levels [65]. Nevertheless, the same authors also reported that, using the cultivar Dasan and the As  treatment reported above, the metalloid provoked a decrease in the ascorbate and GSH contents.  Therefore, this issue needs further research to better understand the dynamics of GSH in combination  with ascorbate and the AGC.  Regarding the SOD isozymes detected in nondenaturing PAGE, no qualitative differences were  promoted by AsV,  and only slight changes in the activity of the isozymes  were detected in both  organs. The isoenzymatic pattern obtained in this work is somehow different to the one reported  earlier by Shri and colleagues [28]. The cultivar, the growth and the As treatment conditions, besides  the preparation of samples and the electrophoresis handling, could be responsible of such differences.  The electrophoretic and staining resolution reported in the present work confirms that five SODs are  present in rice plants: one Mn‐SOD, one Fe‐SOD and three CuZn‐SODs (I, II and III). Both roots and  shoots share the isoenzymes Mn‐SOD, Fe‐SOD (very low abundance in shoots), CuZn‐SOD I and  CuZn‐SOD II, whereas CuZn‐SOD III could only be detected in the aerial parts. These differences in  the abundance and distribution of the SOD isozymes in both rice organs is not unusual, although it  has  been  observed  in  other  species  under  diverse  stress  situations  [50,78].  Thus,  in  14‐d‐old  Arabidopsis seedlings grown under in vitro conditions in the presence of 500 μM arsenate, one Mn‐ SOD,  one  Fe‐SOD  and  three  CuZn‐SODs  were  identified,  but  any  of  them  showed  significant  differences [22]. A similar behavior was observed in roots and leaves from 27‐day‐old Arabidopsis  plants grown in hydroponic conditions under 500 μM AsV where the SOD isozyme pattern showed  no  significant  changes  [24].  Likewise,  in  garlic  (Allium  sativum  L.)  plants  grown  in  hydroponic  conditions in the presence of AsV 200 μM, the SOD isoenzyme pattern in roots and shoots was also  unaffected  [4].  Nevertheless,  in  pea  plants  grown  under  AsV  50 μM  the  zymogram  was  quite  different. Thus, in roots from untreated plants, one Mn‐SOD and two CuZn‐SODs (I and II) were  identified,  while  in  leaves,  an  additional  Fe‐SOD  isozyme  was  detected.  Under  AsV  stress,  roots  showed a significant decrease of the different isozymes (70% of the Mn‐SOD, 36% of the CuZn‐SOD  I and 68% of the CuZn‐SOD II), while all leaf SOD isozymes were unaffected by AsV [19]. All these  data indicate that the antioxidant defense against As stress seems to be quite different depending on  Agronomy 2020, 10, 1014  14  of  19  the analyzed organs and the plant species, but it may also be affected by length of application, the  plant age, etc.  Two markers of oxidative stress were determined in this work, the H2O2 content and the lipid  peroxidation level. The increase of H2O2 in both organs as a consequence of the arsenic treatment  would  explain the  profile of  the  catalase  and  peroxidase  activities  referred to above.  This higher  content of H2O2 along with the slight increase of lipid peroxidation indicates that a mild oxidative  stress  seems  to  occur  under  the  AsV  concentration  used  in  our  study,  thus  suggesting  that  the  metabolic network from rice plants, under our experimental conditions, has the capacity to palliate  the oxidative stress which is usually associated with arsenic stress.  The profile followed by the H2O2 should be also viewed under the perspective of the nitric oxide  (NO) content observed after treatment with arsenic in both organs. NO is a gas radical with important  signaling and regulatory functions in plants. Thus, it has been demonstrated that NO is involved in  germination, development, senescence, and fruit ripening [79–82] and in the response against biotic  and  abiotic  stresses  [83–85].  It  has  been  found  that  the  application  of  exogenous  NO  provides  resistance to metal stress including cadmium [86] and aluminum [87], but also arsenic [88]. Thus, it  has been also reported that the treatment of Vicia faba with sodium nitroprusside (SNP), a NO donor,  improves the tolerance to arsenic (As) toxicity by increasing the antioxidant attributes of plants [89].  Likewise, the exogenous supplementation of SNP to Brassica juncea seedlings palliated the inhibitory  role of As‐III through the alteration of nutrients, amino acids and auxin redistribution [90]. In O. sativa  seedling  the  treatment  with  NO  in  combination  with  AsIII  diminished  the  accumulation  of  As,  improved the changes underwent by the root architecture, and reduced the ROS generation among,  other advantages [91]. At the cell/tissue levels, NO can interact with H2O2 [92], and this may allow  setting up a series of complex biochemical networks to help the plant responds against the arsenic  impact.  5. Conclusions and Future Prospects  Rice  grains  accumulate  arsenic  at  a  certain  level,  which  is  a  threat  for  a  huge  population,  especially for citizens living in Western Asia where this cereal is a major food and part of their daily  intake.  Arsenic  reduces  plant  growth  and  provokes  oxidative  stress  in  most  crops  of  agronomic  interest. Besides issuing and improving the policies against those practices that favor environmental  pollution (including direct soil contamination by As and through irrigation water), a good knowledge  on how the metabolism of the rice plant responds against the harm induced by As is elementary to  developing  biotechnological  strategies  to  alleviate  the  metalloid  effects.  Setting  the  threshold  concentration which triggers most of the metabolic responses provoked by As may help to devise  priming programs. Our results indicate that a mild oxidative stress occurs at 50 μM AsV and this  could be considered as the threshold concentration. Thus, under our experimental conditions, As‐ induced stress is accompanied by a differential response of the ROS metabolism between roots and  shoots.  The  enzymes  involved  in  the  H2O2  redox  homeostasis  are  the  most  significantly  affected  (catalase, APX and POD). A remarkable and significant induction of POD 3 in roots could compensate  for the loss of the APX activity in this organ.   Our data also provide evidence for a relevant role of NO in coordination with other signaling  molecules such as H2O2, as was also proposed elsewhere [93,94]. Therefore, due to its signaling and  regulatory potentialities, the development of biotechnological tools based on the NO biochemistry  could help to obtain plants with improved capacity to cope against As. This perspective can be also  combined with alternative proposals to alleviate As damage such as those which involve treatment  with the nontoxic selenium (Se) [8,39,40,95], salicylic acid, 24‐epi‐brassinolide and silicon [60], or even  leaf extracts from certain plants such as neem (Azadirachta indica) and Tulsi (Ocimum sanctum) [31].   Agronomy 2020, 10, 1014  15  of  19  Author  Contributions:  Performed  the  experimental  works,  E.S.;  participated  in  the  data  analyses,  S.G.‐G.;  designed  the  research,  discussed  the  data  and  participated  in  writing  the  manuscript,  J.M.P.  and  F.J.C.  All  authors have read and agreed to the published version of the manuscript.  Funding: This work was supported by ERDF‐cofinanced grants from the Ministry of Science and Innovation  (Recupera  2020‐20134R056  and  PID2019‐103924GB‐I00),  Junta  de  Andalucía  (group  BIO192),  and  CSIC  (COOPB20171), Spain.  Acknowledgments: The helpful assistance of the technicians Carmelo Ruiz Torres and María Jesús Campos is  acknowledged. LC‐ES/MS and mineral analyses were carried out at the Instrumental Technical Services of the  Estación Experimental del Zaidín (CSIC)  Conflicts of Interest: Authors declare no conflicts of interest.  References  1. Zhao, F.J.; McGrath, S.P.; Meharg, A.A. Arsenic as a food chain contaminant: Mechanisms of plant uptake  and metabolism and mitigation strategies. Annu. Rev. Plant Biol. 2010, 61, 535–559.  2. Sarkar,  A.;  Paul,  B.  The  global  menace  of  arsenic  and  its  conventional  remediation—A  critical  review.  Chemosphere 2016, 158, 37–49.  3. Clemens, S.; Ma, J.F. Toxic heavy metal and metalloid accumulation in crop plants and foods. Annu. Rev.  Plant Biol. 2016, 67, 489–512.  4. Ruiz‐Torres, C.; Feriche‐Linares, R.; Rodríguez‐Ruíz, M.; Palma, J.M.; Corpas, F.J. Arsenic‐induced stress  activates sulfur metabolism in different organs of garlic (Allium sativum L.) plants accompanied by a general  decline of the NADPH‐generating systems in roots. J. Plant Physiol. 2017, 211, 27–35.  5. Abbas, G.; Murtaza, B.; Bibi, I.; Shahid, M.; Niazi, N.K.; Khan, M.I.; Amjad, M.; Hussain, M.; Tahir, N.  Arsenic uptake, toxicity, detoxification, and speciation in plants: Physiological, biochemical, and molecular  aspects. Int. J. Environ. Res. Public Health 2018, 15, 59.  6. Rodríguez‐Ruiz, M.; Aparicio‐Chacón, M.V.; Palma, J.M.; Corpas, F.J. Arsenate disrupts ion balance, sulfur  and nitric oxide metabolisms in roots and leaves of pea (Pisum sativum L.) plants. Environ. Exp. Bot. 2019,  161, 143–156.  7. Alam, M.Z.; Hoque, M.A.; Ahammed, G.J.; McGee, R.; Carpenter‐Boggs, L. Arsenic accumulation in lentil  (Lens culinaris) genotypes and risk associated with the consumption of grains. Sci. Rep. 2019, 9, 9431.  8. Ali, W.; Zhang, H.; Junaid, M.; Mao, K.; Xu, N.; Chang, C.Y.; Rasool, A.; Aslam, M.; Ali, J.; Yang, Z.G.  Insights into the mechanisms of arsenic‐selenium interactions and the associated toxicity in plants, animals,  and humans: A critical review. Crit. Rev. Environ. Sci. Technol. 2020, doi:10.1080/10643389.2020.1740042.  9. Ventura‐Lima,  J.;  Bogo,  M.R.;  Monserrat,  J.M.  Arsenic  toxicity  in  mammals  and  aquatic  animals:  A  comparative biochemical approach. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2011, 74, 211–218.  10. Abdul, K.S.; Jayasinghe, S.S.; Chandana, E.P.; Jayasumana, C.; De Silva, P.M. Arsenic and human health  effects: A review. Environ. Toxicol. Pharmacol. 2015, 40, 828–846.  11. Escudero‐Lourdes, C. Toxicity mechanisms of arsenic that are shared with neurodegenerative diseases and  cognitive impairment: Role of oxidative stress and inflammatory responses. Neurotoxicology 2016, 53, 223– 235.  12. Palma‐Lara,  I.;  Martínez‐Castillo,  M.;  Quintana‐Pérez,  J.C.;  Arellano‐Mendoza,  M.G.;  Tamay‐Cach,  F.;  Valenzuela‐Limón, O.L.; García‐Montalvo, E.A.; Hernández‐Zavala, A. Arsenic exposure: A public health  problem leading to several cancers. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2020, 110, doi: 10.1016/j.yrtph.2019.104539.  13. Islam, E.; Khan, M.T.; Irem, S. Biochemical mechanisms of signaling: Perspectives in plants under arsenic  stress. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2015, 114, 126–133.  14. Abedi, T.; Mojiri, A. Arsenic uptake and accumulation mechanisms in rice species. Plant 2020, 9, 129.  15. Song, W.Y.; Mendoza‐Cózatl, D.G.; Lee, Y.; Schroeder, J.I.; Ahn, S.N.; Lee, H.S.; Wicker, T.; Martinoia, E.  Phytochelatin‐metal(loid)  transport  into  vacuoles  shows  different  substrate  preferences  in  barley  and  Arabidopsis. Plant Cell Environ. 2014, 37, 1192–1201.  16. Tang,  Z.;  Chen,  Y.;  Miller,  A.J.;  Zhao,  F.J.  The  C‐type  ATP‐binding  cassette  transporter  OsABCC7  is  involved in the root‐to‐shoot translocation of arsenic in rice. Plant Cell Physiol. 2019, 60, 1525–1535.  17. Schmöger, M.E.; Oven, M.; Grill, E. Detoxification of arsenic by phytochelatins in plants. Plant Physiol. 2000,  122, 793–801.  Agronomy 2020, 10, 1014  16  of  19  18. Lee, D.A.; Chen, A.; Schroeder, J.I. ars1, an Arabidopsis mutant exhibiting increased tolerance to arsenate  and increased phosphate uptake. Plant J. 2003, 35, 637–646.  19. Quaghebeur,  M.;  Rengel,  Z.  Arsenic  uptake,  translocation  and  speciation  in  pho1  and  pho2  mutants  of  Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 2004, 120, 280–286.  20. Li,  Y.;  Dhankher,  O.P.;  Carreira,  L.;  Lee,  D.;  Chen,  A.;  Schroeder,  J.I.;  Balish,  R.S.;  Meagher,  R.B.  Overexpression  of  phytochelatin  synthase  in  Arabidopsis  leads  to  enhanced  arsenic  tolerance  and  cadmium hypersensitivity. Plant Cell Physiol. 2004, 45, 1787–1797.  21. Bienert, G.P.; Jahn, T.P. Major intrinsic proteins and arsenic transport in plants: New players and their  potential role. Adv. Exp. Med. Biol. 2010, 679, 111–125.  22. Leterrier, M.; Airaki, M.; Palma, J.M.; Chaki, M.; Barroso, J.B.; Corpas, F.J. Arsenic triggers the nitric oxide  (NO) and S‐nitrosoglutathione (GSNO) metabolism in Arabidopsis. Environ. Pollut. 2012, 166, 136–143.  23. Leterrier,  M.;  Barroso,  J.B.;  Palma,  J.M.;  Corpas,  F.J.  Cytosolic  NADP‐isocitrate  dehydrogenase  in  Arabidopsis leaves and roots. Biol. Plant. 2012, 56, 705–710.  24. Corpas, F.J.; Aguayo‐Trinidad, S.; Ogawa, T.; Yoshimura, K.; Shigeoka, S. Activation of NADPH‐recycling  systems in leaves and roots of Arabidopsis thaliana under arsenic‐induced stress conditions is accelerated by  knock‐out of Nudix hydrolase 19 (AtNUDX19) gene. J. Plant Physiol. 2016, 192, 81–89.  25. Park, J.H.; Han, Y.S.; Seong, H.J.; Ahn, J.S.; Nam, I.H. Arsenic uptake and speciation in Arabidopsis thaliana  under hydroponic conditions. Chemosphere 2016, 154, 283–288.  26. Finnegan, P.M.; Chen, W. Arsenic toxicity: The effects on plant metabolism. Front. Physiol. 2012, 3, 182.  27. Kofroňová, M.; Hrdinová, A.; Mašková, P.; Tremlová, J.; Soudek, P.; Petrová, S.; Pinkas, D.; Lipavská, H.  Multi‐Component  antioxidative  system  and  robust  carbohydrate  status,  the  essence  of  plant  arsenic  tolerance. Antioxidants 2020, 9, 283.  28. Shri, M.; Kumar, S.; Chakrabarty, D.; Trivedi, P.K.; Mallick, S.; Misra, P.; Shukla, D.; Mishra, S.; Srivastava,  S.;  Tripathi,  R.D.;  et  al.  Effect  of  arsenic  on  growth,  oxidative  stress,  and  antioxidant  system  in  rice  seedlings. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2009, 72, 1102–1110.  29. Dave, R.; Tripathi, R.D.; Dwivedi, S.; Tripathi, P.; Dixit, G.; Sharma, Y.K.; Trivedi, P.K.; Corpas, F.J.; Barroso,  J.B.; Chakrabarty, D. Arsenate and arsenite exposure modulate antioxidants and amino acids in contrasting  arsenic accumulating rice (Oryza sativa L.) genotypes. J. Hazard. Mater. 2013, 262, 1123–1131.  30. Farooq, M.A.; Li, L.; Ali, B.; Gill, R.A.; Wang, J.; Ali, S.; Gill, M.B.; Zhou, W. Oxidative injury and antioxidant  enzymes regulation in arsenic‐exposed seedlings of four Brassica napus L. cultivars. Environ. Sci. Pollut. Res.  Int. 2015, 22, 10699–10712.  31. Gautam, A.; Pandey, A.K.; Dubey, R.S. Azadirachta indica and Ocimum sanctum leaf extracts alleviate arsenic  toxicity by reducing arsenic uptake and improving antioxidant system in rice seedlings. Physiol. Mol. Biol.  Plants 2020, 26, 63–81.  32. Duan, G.; Liu, W.; Chen, X.; Hu, Y.; Zhu, Y. Association of arsenic with nutrient elements in rice plants.  Metallomics 2013, 5, 784–792.  33. Dave, R.; Singh, P.K.; Tripathi, P.; Shri, M.; Dixit, G.; Dwivedi, S.; Chakrabarty, D.; Trivedi, P.K.; Sharma,  Y.K.; Dhankher, O.P.; et al. Arsenite tolerance is related to proportional thiolic metabolite synthesis in rice  (Oryza sativa L.). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2013, 64, 235–242.  34. Lei, M.; Tie, B.; Zeng, M.; Qing, P.; Song, Z.; Williams, P.N.; Huang, Y. An arsenic‐contaminated field trial  to assess the uptake and translocation of arsenic by genotypes of rice. Environ. Geochem. Health 2013, 35,  379–390.  35. Tripathi, P.; Tripathi, R.D.; Singh, R.P.; Dwivedi, S.; Chakrabarty, D.; Trivedi, P.K.; Adhikari, B. Arsenite  tolerance in rice (Oryza sativa L.) involves coordinated role of metabolic pathways of thiols and amino acids.  Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2013, 20, 884–896.  36. Batista, B.L.; Nigar, M.; Mestrot, A.; Rocha, B.A.; Barbosa Junior, F.; Price, A.H.; Raab, A.; Feldmann, J.  Identification  and  quantification  of  phytochelatins  in  roots  of  rice  to  long‐term  exposure:  Evidence  of  individual role on arsenic accumulation and translocation. J. Exp. Bot. 2014, 65, 1467–1479.  37. Begum,  M.C.;  Islam,  M.S.;  Islam,  M.;  Amin,  R.;  Parvez,  M.S.;  Kabir,  A.H.  Biochemical  and  molecular  responses underlying differential arsenic tolerance in rice (Oryza sativa L.). Plant Physiol. Biochem. 2016, 104,  266–277.  38. Chen,  Y.;  Han,  Y.H.;  Cao,  Y.;  Zhu,  Y.G.;  Rathinasabapathi,  B.;  Ma,  L.Q.  Arsenic  transport  in  rice  and  biological solutions to reduce arsenic risk from rice. Front Plant Sci. 2017, 8, 268.  Agronomy 2020, 10, 1014  17  of  19  39. Kalita,  J.;  Pradhan,  A.K.;  Shandilya,  Z.M.;  Tanti,  B.  Arsenic  stress  responses  and  tolerance  in  rice:  Physiological, cellular and molecular approaches. Rice Sci. 2018, 25, 235–249.  40. Singh,  R.;  Upadhyay,  A.K.;  Singh,  D.P.  Regulation  of  oxidative  stress  and  mineral  nutrient  status  by  selenium in arsenic treated crop plant Oryza sativa. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2018, 148, 105–113.  41. Corpas, F.J.; González‐Gordo, S.; Cañas, A.; Palma, J.M. Nitric oxide and hydrogen sulfide in plants: Which  comes first? J. Exp. Bot. 2019, 70, 4391–4404.  42. Palma, J.M.; Freschi, L.; Rodríguez‐Ruiz, M.; González‐Gordo, S.; Corpas, F.J. Nitric oxide in the physiology  and quality of fleshy fruits. J. Exp. Bot. 2019, 70, 4405–4417.  43. Miyake, C.; Asada, K. Inactivation mechanism of ascorbate peroxidase at low concentrations of ascorbate:  Hydrogen peroxide decomposes compound I of ascorbate peroxidase. Plant Cell Physiol. 1996, 36, 661–668.  44. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 1984, 105, 121–126.  45. Hossain, M.A.; Asada, K. Inactivation of ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts on dark addition of  hydrogen peroxide: Its protection by ascorbate. Plant Cell Physiol. 1984, 25, 1285–1295.  46. Hossain,  M.A.;  Nakano,  Y.;  Asada,  K.  Monodehydroascorbate  reductase  in spinach  chloroplast  and  its  participation in regeneration of ascorbate for scavenging of hydrogen peroxide. Plant Cell Physiol. 1984, 25,  385–395.  47. Edwards, E.A.; Rawsthone, S.; Mullineaux, p.M. Subcellular distribution ofmultiple forms of glutathione  reductase in leaves of pea (Pisum sativum L.). Planta 1990, 180, 278–284.  48. Quessada,  M.P.;  Macheix,  J.J.  Caractérisation  d’une  peroxydase  impliquée  spécifiquement  dans  la  lignification, en relation avec l’incompatibilité au greffage chez l’Abricotier. Physiol. Végét. 1984, 22, 533– 540.  49. Beauchamp,  C.;  Fridovich,  I.  Superoxide  dismutase:  Improved  assays  and  an  assay  applicable  to  acrylamide gels. Anal. Biochem. 1971, 44, 276–287.  50. Houmani,  H.;  Rodríguez‐Ruiz,  M.;  Palma,  J.M.;  Abdelly,  C.;  Corpas,  F.J.  Modulation  of  superoxide  dismutase  (SOD)  isozymes  by  organ  development  and  high  long‐term  salinity  in  the  halophyte  Cakile  maritima. Protoplasma 2016, 253, 885–894.  51. Pinilla, M.; Iglesias‐Moya, J.; Campos, M.J.; Corpas, F.J.; Palma, J.M. Pomegranate (Punica  granatum L.)  Fruits: Characterization of the main enzymatic antioxidants (peroxisomal catalase and SOD isozymes) and  the NADPH‐regenerating system. Agronomy 2019, 9, 338.  52. Ádám,  A.L.;  Bestwick,  C.S.;  Barna,  B.;  Mansfield,  J.W.  Enzymes  regulating  the  accumulation  of  active  oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Planta  1995, 197, 240–249.  53. Bradford,  M.M.  A  rapid  and  sensitive  method  for  the  quantitation  of  microgram  quantities  of  protein  utilizing the principle of protein‐dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248–254.  54. Airaki,  M.;  Sánchez‐Moreno,  L.;  Leterrier,  M.;  Barroso,  J.B.;  Palma,  J.M.;  Corpas,  F.J.  Detection  and  quantification of S‐nitrosoglutathione (GSNO) in pepper (Capsicum annuum L.) plant organs by LC‐ES/MS.  Plant Cell Physiol. 2011, 52, 2006–2015.  55. Rodríguez‐Ruiz,  M.;  Mateos,  R.M.;  Codesido,  V.;  Corpas,  F.J.;  Palma,  J.M.  Characterization  of  the  galactono‐1,4‐lactone dehydrogenase from pepper fruits and its modulation in the ascorbate biosynthesis.  Role of nitric oxide. Redox Biol. 2017, 12, 171–181.  56. Buege, J.A.; Aust, S.D. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 1978, 52, 302–310.  57. Chaki, M.; Álvarez de Morales, P.; Ruiz, C.; Begara‐Morales, J.C.; Barroso, J.B.; Corpas, F.J.; Palma, J.M.  Ripening  of  pepper  (Capsicum  annuum)  fruit  is  characterized  by  an  enhancement  of  protein  tyrosine  nitration. Ann. Bot. 2015, 116, 637–647.  58. Palma,  J.M.;  Garrido,  M.;  Rodríguez‐García,  M.I.;  del  Río,  L.A.  Peroxisome  proliferation  and  oxidative  stress mediated by activated oxygen species in plant peroxisomes. Arch. Biochem. Biophys. 1991, 287, 68–74.  59. Chandrakar,  V.;  Naithani,  S.C.;  Keshavkant,  S.  Arsenic‐induced  metabolic  disturbances  and  their  mitigation mechanisms in crop plants: A review. Biologia 2016, 71, 367–377.  60. Maghsoudi, K.; Arvin, M.J.; Ashraf, M. Mitigation of arsenic toxicity in wheat by the exogenously applied  salicylic acid, 24‐epi‐brassinolide and silicon. J. Soil Sci. Plant Nutr. 2020, 2, 577–588.  61. Kumarathilaka, P.; Seneweera, S.; Meharg, A.; Bundschuh, J. Arsenic speciation dynamics in paddy rice  soil‐water environment: Sources, physico‐chemical, and biological factors—A review. Water Res. 2018, 140,  403–414.  Agronomy 2020, 10, 1014  18  of  19  62. Majumder,  B.;  Das,  S.;  Mukhopadhyay,  S.;  Biswas,  A.K.  Identification  of  arsenic‐tolerant  and  arsenic‐ sensitive  rice (Oryza  sativa L.)  cultivars on  the basis of arsenic  accumulation assisted  stress  perception,  morpho‐biochemical responses, and alteration in genomic template stability. Protoplasma 2019, 256, 193– 211.  63. Otero, X.L.; Atiaga, O.; Estrella, R.; Tierra, W.; Ruales, J.; Zayas, L.; Souza, V., Jr.; Ferreira, T.O.; Nóbrega,  G.N.; Oliveira, D.P.; et al. Geographical variations in arsenic contents in rice plants from Latin America and  the Iberian Peninsula in relation to soil conditions. Environ. Geochem. Health 2020, doi:10.1007/s10653‐020‐ 00581‐8.  64. Chowdhury, N.R.; Das, A.; Joardar, M.; De, A.; Mridha, D.; Das, R.; Rahman, M.M.; Roychowdhury, T.  Flow of arsenic between rice grain and water: Its interaction, accumulation and distribution in different  fractions of cooked rice. Sci. Total Environ. 2020, 731,138937.  65. Jung, H.I.; Kong, M.S.; Lee, B.R.; Kim, T.H.; Chae, M.J.; Lee, E.J.; Jung, G.B.; Lee, C.H.; Sung, J.K.; Kim, Y.H.  Exogenous glutathione increases arsenic translocation into shoots and alleviates arsenic‐induced oxidative  stress by sustaining ascorbate‐glutathione homeostasis in rice seedlings. Front. Plant Sci. 2019, 10, 1089.  66. Kumwimba,  M.N.;  Zeng,  X.;  Bai,  L.;  Wang,  J.  A  preliminary  study  on  genetic  variation  of  arsenic  concentration in 32 different genotypes of leafy vegetable. Environ. Pollut. 2014, 3, 72–87.  67. Mhamdi, A.; Queval, G.; Chaouch, S.; Vanderauwera, S.; Van Breusegem, F. Catalase function in plants: A  focus on Arabidopsis mutants as stress‐mimic models. J. Exp. Bot. 2010, 61, 4198–4220.  68. Mhamdi, A.; Noctor, G.; Baker, A. Plant catalases: Peroxisomal redox guardians. Arch. Biochem. Biophys.  2012, 525, 1–194.  69. Anjum,  N.A.;  Sharma,  P.;  Gill,  S.S.;  Hasanuzzaman,  M.;  Khan,  E.A.;  Kachhap,  K.;  Mohamed,  A.A.;  Thangavel, P.; Devi, G.D.; Vasudhevan, P.; et al. Catalase and ascorbate peroxidase‐representative H2O2‐ detoxifying heme enzymes in plants. Environ. Sci. Pollut. Res. 2016, 23, 19002–19029.  70. Rodríguez‐Ruiz, M.; González‐Gordo, S.; Cañas, A.; Campos, M.J.; Paradela, A.; Corpas, F.J.; Palma, J.M.  Sweet pepper (Capsicum annuum L.) fruits contain an atypical peroxisomal catalase that is modulated by  reactive oxygen and nitrogen species. Antioxidants 2019, 8, 374.  71. Palma, J.M.; Mateos, R.M.; López‐Jaramillo, J.; Rodríguez‐Ruiz, M.; González‐Gordo, S.; Lechuga‐Sancho,  A.M.; Corpas, F.J. Plant catalases as NO and H2S targets. Redox Biol. 2020, 34, 101525.  72. Kidwai, M.; Dhar, Y.V.; Gautam, N.; Tiwari, M.; Ahmad, I.Z.; Asif, M.H.; Chakrabarty, D. Oryza sativa class  HI  peroxidase  (OsPRX38)  overexpression  in  Arabidopsis  thaliana  reduces  arsenic  accumulation  due  to  apoplastic lignification. J. Hazard. Mat. 2019, 362, 383–393.  73. Teixeira,  F.K.;  Menezes‐Benavente,  L.;  Margis,  R.;  Margis‐Pinheiro,  M.  Analysis  of  the  molecular  evolutionary history of the ascorbate peroxidase gene family: Inferences from the rice genome. J. Mol. Evol.  2004, 59, 761–770.  74. Bonifacio, A.; Martins, M.O.; Ribeiro, C.W.; Fontenele, A.V.; Carvalho, F.E.; Margis‐Pinheiro, M.; Silveira,  J.A. Role of peroxidases in the compensation of cytosolic ascorbate peroxidase knockdown in rice plants  under abiotic stress. Plant Cell Environ. 2011, 34, 1705–1722.  75. Gupta, D.K.; Tripathi, R.D.; Mishra, S.; Srivastava, S.; Dwivedi, S.; Rai, U.N.; Yang, X.E.; Huanji, H.; Inouhe,  M. Arsenic accumulation in root and shoot vis‐a‐visits effects on growth and level of phytochelatins in  seedlings of Cicer arietinum L. J. Environ. Biol. 2008, 29, 281–286.  76. Kim, D.Y.; Park, H.; Lee, S.H.; Koo, N.; Kim, J.G. Arsenate tolerance mechanism of Oenothera odorata from  a mine population involves the induction of phytochelatins in roots. Chemosphere 2009, 75, 505–512.  77. Zhang, H.; Xu, W.; Guo, J.; He, Z.; Ma, M. Coordinated responses of phytochelatins and metallothioneins  to heavy metals in garlic seedlings. Plant Sci. 2005, 169, 1059–1065.  78. del Río, L.A.; Corpas, F.J.; López‐Huertas, E.; Palma, J.M. Plant superoxide dismutases: Function under  abiotic stress conditions. In Antioxidants and Antioxidant Enzymes in Higher Plants; Gupta, D.K., Palma, J.M.,  Corpas, F.J., Eds.; Springer International Publishing: Cham, Switzerland, 2018; pp. 1–26.  79. Yu,  M.;  Lamattina,  L.;  Spoel,  S.H.;  Loake,  G.J.  Nitric  oxide  function  in  plant  biology:  A  redox  cue  in  deconvolution. New Phytol. 2014, 202, 1142–1156.  80. Corpas, F.J.; Palma, J.M. Nitric oxide on/off in fruit ripening. Plant Biol. (Stuttg.) 2018, 20, 805–807.  81. Takahashi,  M.;  Morikawa,  H.  Nitrate,  but  not  nitrite,  derived  from  nitrogen  dioxide  accumulates  in  Arabidopsis  leaves  following  exposure  to  N‐labeled  nitrogen  dioxide.  Plant  Signal.  Behav.  2019,  14,  1559579.  Agronomy 2020, 10, 1014  19  of  19  82. Kolbert, Z.; Barroso, J.B.; Brouquisse, R.; Corpas, F.J.; Gupta, K.J.; Lindermayr, C.; Loake, G.J.; Palma, J.M.;  Petřivalský, M.; Wendehenne, D.; et al. A forty year journey: The generation and roles of NO in plants.  Nitric Oxide 2019, 93, 53–70.  83. Chaki,  M.;  Fernández‐Ocaña,  A.M.;  Valderrama,  R.;  Carreras,  A.;  Esteban,  F.J.;  Luque,  F.;  Gómez‐ Rodríguez,  M.V.;  Begara‐Morales,  J.C.;  Corpas,  F.J.;  Barroso,  J.B.  Involvement  of  reactive  nitrogen  and  oxygen species (RNS and ROS) in sunflower‐mildew interaction. Plant Cell Physiol. 2009, 50, 265–279.  84. León, J.; Castillo, M.C.; Coego, A.; Lozano‐Juste, J.; Mir, R. Diverse functional interactions between nitric  oxide and abscisic acid in plant development and responses to stress. J. Exp. Bot. 2014, 65, 907–921.  85. Houmani, H.; Rodríguez‐Ruiz, M.; Palma, J.M.; Corpas, F.J. Mechanical wounding promotes local and long  distance  response  in  the  halophyte  Cakile  maritima  through  the  involvement  of  the  ROS  and  RNS  metabolism. Nitric Oxide 2018, 74, 93–101.  86. Laspina, N.V.; Groppa, M.D.; Tomaro, M.L.; Benavides, M.P. Nitric oxide protects sunflower leaves against  Cd‐induced oxidative stress. Plant Sci. 2005, 169, 323–330.  87. Wang, Y.S.; Yang, Z.M. Nitric oxide reduces aluminum toxicity by preventing oxidative stress in the roots  of Cassia tora L. Plant Cell Physiol. 2005, 46, 1915–1923.  88. Singh,  A.P.;  Dixit,  G.;  Kumar,  A.;  Mishra,  S.;  Singh,  P.K.;  Dwivedi,  S.;  Trivedi,  P.K.;  Chakrabarty,  D.;  Mallick, S.; Pandey, V.; et al. Nitric oxide alleviated arsenic toxicity by modulation of antioxidants and thiol  metabolism in rice (Oryza sativa L.). Front. Plant Sci. 2016, 6, 1272.  89. Ahmad, P.; Alam, P.; Balawi, T.H.; Altalayan, F.H.; Ahanger, M.A.; Ashraf, A. Sodium nitroprusside (SNP)  improves tolerance to arsenic (As) toxicity in Vicia faba through the modifications of biochemical attributes,  antioxidants, ascorbate‐glutathione cycle and glyoxalase cycle. Chemosphere 2020, 244, 125480.  90. Praveen, A.; Pandey, A.; Gupta, M. Nitric oxide alters nitrogen metabolism and PIN gene expressions by  playing protective role in arsenic challenged Brassica juncea L. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2019, 176, 95–107.  91. Praveen, A.; Gupta, M. Nitric  oxide  confronts arsenic stimulated  oxidative  stress and  root architecture  through distinct gene expression of auxin transporters, nutrient related genes and modulates biochemical  responses in Oryza sativa L. Environ. Pollut. 2018, 240, 950–962.  92. Gupta, D.K.; Palma, J.M.; Corpas, F.J. (Eds.) Nitric Oxide and Hydrogen Peroxide in Higher Plants; Springer  Nature Switzerland AG: Cham, Switzerland, 2019.  93. Terrón‐Camero, L.C.; Peláez‐Vico, M.A.; Del‐Val, C.; Sandalio, L.M.; Romero‐Puertas, M.C. Role of nitric  oxide in plant responses to heavy metal stress: Exogenous application versus endogenous production. J.  Exp. Bot. 2019, 70, 4477–4488.  94. Piacentini, D.; Corpas, F.J.; D’Angeli, S.; Altamura, M.M.; Falasca, G. Cadmium and arsenic‐induced‐stress  differentially modulates Arabidopsis root architecture, peroxisome distribution, enzymatic activities and  their nitric oxide content. Plant Physiol. Biochem. 2020, 148, 312–323.  95. Camara, A.Y.; Wan, Y.N.; Yu, Y.; Wang, Q.; Wang, K.; Li, H.F. Effect of endogenous selenium on arsenic  uptake and antioxidative enzymes in as‐exposed rice seedlings. Int. J. Environ. Res. Public Health 2019, 16,  3350.  © 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access  article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution  (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).  http://www.deepdyve.com/assets/images/DeepDyve-Logo-lg.png Agronomy Multidisciplinary Digital Publishing Institute

Reactive Oxygen Species (ROS) Metabolism and Nitric Oxide (NO) Content in Roots and Shoots of Rice (Oryza sativa L.) Plants under Arsenic-Induced Stress

Loading next page...
 
/lp/multidisciplinary-digital-publishing-institute/reactive-oxygen-species-ros-metabolism-and-nitric-oxide-no-content-in-Js4Tj60Tdc

References (95)

Publisher
Multidisciplinary Digital Publishing Institute
Copyright
© 1996-2020 MDPI (Basel, Switzerland) unless otherwise stated Disclaimer The statements, opinions and data contained in the journals are solely those of the individual authors and contributors and not of the publisher and the editor(s). Terms and Conditions Privacy Policy
ISSN
2073-4395
DOI
10.3390/agronomy10071014
Publisher site
See Article on Publisher Site

Abstract

Article  Reactive Oxygen Species (ROS) Metabolism and  Nitric Oxide (NO) Content in Roots and Shoots of  Rice (Oryza sativa L.) Plants under   Arsenic‐Induced Stress  1 2 2 2,   Ernestina Solórzano  , Francisco J. Corpas  , Salvador González‐Gordo   and José M. Palma  *   Departmento de Medio Ambiente, Instituto de Ciencias y Tecnologías Aplicadas (INSTEC), Quinta de los  Molinos, Ave. Salvador Allende, Plaza de la Revolución, La Habana 1110, Cuba; esolorza@instec.cu    Group of Antioxidants, Free Radicals and Nitric Oxide in Biotechnology, Food and Agriculture,  Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology of Plants, Estación Experimental del Zaidín,  CSIC, Apartado 419, E‐18080 Granada, Spain; javier.corpas@eez.csic.es (F.J.C.);  salvador.gonzalez@eez.csic.es (S.G.‐G.)  *  Correspondence: josemanuel.palma@eez.csic.es; Tel: +34‐958‐181‐600  Received: 25 May 2020; Accepted: 12 July 2020; Published: 14 July 2020  Abstract: Arsenic (As) is a highly toxic metalloid for all forms of life including plants. Rice is the  main food source for different countries worldwide, although it can take up high amounts of As in  comparison with other crops, showing toxic profiles such as decreases in plant growth and yield.  The induction of oxidative stress is the main process underlying arsenic toxicity in plants, including  rice, due to an alteration of the reactive oxygen species (ROS) metabolism. The aim of this work was  to gain better knowledge on how the ROS metabolism and its interaction with nitric oxide (NO)  operate under As stress conditions in rice plants. Thus, physiological and ROS‐related biochemical  parameters in roots and shoots from rice (Oryza sativa L.) were studied under 50 μM arsenate (AsV)  stress, and the involvement of the main antioxidative systems and NO in the response of plants to  those conditions was investigated. A decrease of 51% in root length and 27% in plant biomass was  observed with 50 μM AsV treatment, as compared to control plants. The results of the activity of  superoxide dismutase (SOD) isozymes, catalase, peroxidase (POD: total and isoenzymatic), and the  enzymes of the ascorbate–glutathione cycle, besides the ascorbate and glutathione contents, showed  that As accumulation provoked an overall significant increase of most of them, but with different  profiles  depending  on  the  plant  organ,  either  root  or  shoot.  Among  the  seven  identified  POD  isozymes, the induction of the POD‐3 in shoots under As stress could help to maintain the hydrogen  peroxide  (H2O2)  redox  homeostasis  and  compensate  the  loss  of  the  ascorbate  peroxidase  (APX)  activity in both roots and shoots. Lipid peroxidation was slightly increased in roots and shoots from  As‐treated plants. The H2O2 and NO contents were enhanced in roots and shoots against arsenic  stress. In spite of the increase of most antioxidative systems, a mild oxidative stress situation appears  to be consolidated overall, since the growth parameters and those from the oxidative damage could  not  be  totally  counteracted.  In  these  conditions,  the  higher  levels  of  H2O2  and  NO  suggest  that  signaling events are simultaneously occurring in the whole plant.  Keywords:  antioxidants;  ascorbate;  glutathione;  hydrogen  peroxide;  isoenzyme;  nitric  oxide;  superoxide dismutase  Agronomy 2020, 10, 1014; doi:10.3390/agronomy10071014  www.mdpi.com/journal/agronomy  Agronomy 2020, 10, 1014  2  of  19  1. Introduction  Arsenic (As) is one of the major environmental pollutants distributed worldwide, although it  concentrates  especially  in  certain  areas,  since  this  metalloid  is  a  byproduct  of  industrial  and  agricultural  (through  the  use  of  fertilizers)  activities.  Arsenic  is  highly  toxic  for  all  forms  of  life  including plants, and can affect all links in the trophic chain [1–8]. Consequently, As‐contaminated  groundwater and food are serious health risks, because As may enter organisms by different ways  [1]. In animals, As interrupts the mitochondrial ATP production at different levels, but it also disrupts  the  cellular  electrolytic  function  interfering  on the  voltage‐gated potassium  channels (VGKCs).  It  results in neurological imbalances, high blood pressure, cardiovascular episodes, anemia and even  death [9–12]. In plants, As provokes developmental negative effects [13], although plant sensitivity  can significantly vary among species and among cultivars within the same species.  Plants undergo contamination by arsenic due to the anionic forms of the metalloid, both arsenate  (AsV) and arsenite (AsIII). This latter form reacts with protein sulfhydryl (‐SH) groups triggering  cellular dysfunction which can lead to cell death. AsV is an analog to phosphate, one of the most  important macronutrients in plants, thus competing through phosphate transporters and nodulin 26‐ like intrinsic channels in the root uptake mechanism [14]. Once in the cytoplasm it can disrupt the  cell  metabolism  by  replacing  phosphate  in  ATP,  thus  giving  rise  to  the  unstable  form  ADP/As  (adenosine‐5′‐diphosphate/arsenate). In root cells, AsV is reduced to AsIII by the arsenate reductase,  which is a more toxic species. This reaction is accompanied by the concomitant conversion of reduced  glutathione (GSH) to the oxidized form (GSSG) of this tripeptide. AsIII can be detoxified through  soluble thiols such as the plant’s own GSH, but also via phytochelatins (PCs), small polypeptides rich  in GSH [4]. Arsenite can also be mobilized for its vacuolar sequestration by virtue of the activity of  ABC (ATP‐binding cassette) transporters [15,16].  In plants, all tissues are prone to be adversely affected by arsenic and diverse approaches have  been developed to accomplish this research. Although much of the knowledge on the biochemical  and molecular mechanisms underlying As toxicity in plant cells has been obtained from the use of  plant models such as Arabidopsis thaliana [17–25], the transport, metabolism, accumulation, toxicity  and detoxification of As have been thoroughly studied in many species under different perspectives  including the existence of hyper‐accumulation mechanisms, because it occurs in some plant species,  as  well as the  synthesis  of  phytochelatins, and  the metabolism  of  reactive  oxygen  species (ROS),  among  others  [1,4,17,20–23,26,27].  In  fact,  the  induction  of  oxidative  stress  is  the  main  process  underlying arsenic toxicity in plants. Accordingly, plants basically respond to oxidative stress by  increasing  the  production  of  antioxidant  enzymes  [4,27–31].  Thus,  the  activity  of  catalase  (CAT),  superoxide  dismutase  (SOD),  ascorbate  peroxidase  (APX),  and  glutathione  reductase  (GR)  from  rapeseed  (Brassica  napus)  has  been  reported  to  follow  a  positive  correlation  with  increasing  As  concentrations [30] and, similarly, a correlation between arsenic accumulation in the different organs  and the antioxidative response of garlic (Allium sativum) was found [4,27,31]. On the contrary, it was  also recently reported that As inhibits CAT activity in Arabidopsis thaliana.  Commonly, agronomic species with a low tolerance against arsenic show toxic profiles such as  a decrease in plant growth and crop yield. Among the main agronomic species consumed worldwide,  rice (Oryza sativa L.) is one of the most studied under As stress conditions [28,32–40]. Rice is the main  food source for many countries and it is well known that this species is susceptible to accumulating  moderate/high As concentrations in whole plants and grains [33,34,38]. Thus, rice usually takes up  arsenic in the form of methylated arsenic (o‐As) and inorganic arsenic species (i‐As) [34,36]. This As  uptake  notably  influences  the  translocation  of  nutrients  into  rice  plants  and,  consequently,  the  nutritional mineral composition in countries where this cereal is the basis for the human diet [32].  Diverse  effects  exerted  by  the  metalloid  in  rice  plants  have  been  reported.  A  common  response  consisting of the synthesis of PCs to complex arsenic has been described, as well as a thiolic metabolite  synthesis coordinated and proportional to the tolerance to such metalloid [29,32,35,36]. On the other  hand,  early  studies  with  arsenic  treatment  in  this  species  showed  that  an  accumulation  of  As  occurred,  accompanied  by  an  up‐regulation  of  SOD,  APX,  GR,  and  peroxidase  along  with  an  increased malondialdehyde (MDA) content [28]. This redox pattern, which matches with oxidative  Agronomy 2020, 10, 1014  3  of  19  stress conditions, was later reported but was also associated with imbalances of the profiles of certain  amino acids such as proline, cysteine, glycine, glutamic acid and methionine, the content of which  was higher in rice varieties, showing a higher tolerance to As [29,37]. All this evidence associates As  to oxidative stress, although knowledge gaps still remain on some aspects, such as the whole redox  metabolic picture displayed in both roots and aerials parts, and what the interconnection is regarding  the ROS/antioxidant metabolism with some modulating molecules such as nitric oxide (NO). In fact,  NO is a gas radical which, together with its derived reactive nitrogen species (RNS), display powerful  regulatory functions in many physiological processes and under stress conditions in plants [41,42].  The  aim  of  this  work  was  to  gain  better  knowledge  on  how  the  ROS  metabolism  and  its  interaction with NO operate under As stress conditions in rice plants. Thus, physiological and ROS‐ related biochemical parameters in roots and shoots from rice (Oryza sativa L.) were studied under 50  μM arsenate (AsV) stress, and the involvement of the main antioxidative systems and NO in the  response  of  plants  to  those  conditions  was  investigated.  The  pattern  of  two  important  signaling  molecules such as H2O2 and NO, along with that of MDA, suggests that As at 50 μM provokes a  situation of mild oxidative stress where the interaction between H2O2 and NO might be responsible  for the responses issued by plants.  2. Materials and Methods  2.1. Plant Material and Growth Conditions  Rice (Oryza sativa L) seeds were planted and grown in vermiculite for 14 d under controlled  conditions. Healthy and vigorous seedlings (n = 36) were selected and transplanted to hydroponic  culture  in  4  L  plastic  pots  in  aerated  full  nutrient  media  under  optimal  conditions  in  a  growth  chamber. After 14 d, nutrient solution was added with 0, 10, 25, 50,  100, and 200 μM potassium  dihydrogen arsenate (KH2AsO4) which corresponds to the AsV form. The AsV form was used in our  study  since  AsIII  is  predominant  under  anaerobic  flooded  conditions,  whereas  AsV  is  the  most  appropriate  to  improve  crop  yield  under  P  fertilization  [32].  Our  experimental  conditions,  with  aerated full nutrient media, including P, fit better with the use of AsV. Then, plants were grown for  −2 −1 12 d at 22/18 °C, day/night temperatures, a photoperiod of 16 h, and 100–120 μmol m s  irradiance  (Figure 1). The composition of the nutrient solution was: 1 mM Ca(NO3)2,1 mM KH2PO4, 1 mM KNO3,  1 mM MgSO4, 50 μM Na–Fe–EDTA, 46 μM H3BO3, 10 μM MnSO4, 0.77 μM ZnSO4, 0.32 μM CuSO4,  0.58 μM Na2MoO4, 0.01 μM CoCl2 and pH adjusted to 6.0 with KOH. After the growth period, roots  and  leaves  from  the  control  and  AsV‐treated  plants  were  harvested  and  used  for  analytical  and  biochemical assays. Length and fresh weight were measured in roots, shoots and whole plants from  all treatments.  Figure 1. Experimental design of the arsenate effect on 26‐d‐old rice seedlings grown in hydroponic  solutions supplemented the last 12 days with 50 μM arsenate (AsV).  Agronomy 2020, 10, 1014  4  of  19  2.2. Arsenic and Main Nutrient Contents  Arsenic‐treated and untreated full plants were washed with Milli‐Q water containing 0.1 mM  ethylene  tetraacetic  acid  (EDTA).  Then,  roots  and  shoots  were  separated,  dried  for  8  h  at  80  °C,  pulverized, and digested for 90 min (total time) in a HNO3:HClO4 (2:1; v/v) solution. Mineral arsenic,  and  some  macro‐  (K,  P,  S),  and  micro‐nutrients  (Fe,  Cu  and  Mn)  were  analyzed  by  inductively  coupled plasma spectrometry using a Varian720‐ES ICP‐OES spectrometer (Varian ICP 720‐ES, Santa  Clara, California, USA). The root to shoot translocation factor (TFroot to shoot) was considered as the  ability of plants to translocate As from roots to the aerial parts and was estimated through the formula  TFroot to shoot = [As shoot]/[As root] [4].  2.3. Preparation of Crude Extracts for Enzyme and Lipid Peroxidation Assays  Plant material was frozen under liquid N2 and pulverized in a mortar with a pestle. The powder  was suspended in a homogenizing medium composed of 50 mM Tris‐HCl, pH 7.8, 0.1 mM EDTA,  10% (v/v) glycerol, 0.2% (v/v) Triton X‐100, and 5 mM dithiothreitol (DTT). For the determination of  APX  activity,  2  mM  ascorbate  was  added  to  the  homogenizing  medium  to  preserve  the  enzyme  activity [43]. Homogenates were centrifuged 25 min at 15,000 g, 4 °C, and supernatants were used  immediately for assays.  2.4. Enzyme Activity Assays  Catalase (EC 1.11.1.6) activity was determined at 240 nm by following the breakdown of H2O2  [44].  Ascorbate  peroxidase  (APX;  EC  1.11.1.11)  was  plotted  by  monitoring  the  initial  ascorbate  oxidation  by  H2O2  at  290  nm  [45].  Monodehydroascorbate  reductase  (MDAR;  EC  1.6.5.4)  was  measured by assaying the monodehydroascorbate‐dependent NADH oxidation. In these assays, the  monodehydroascorbate was generated through the ascorbate/ascorbate oxidase system, as reported  earlier [46]. The rate of monodehydroascorbate‐independent NADH oxidation (without ascorbate  oxidase and ascorbate) was subtracted from the monodehydroascorbate‐dependent reaction. GR (EC  1.6.4.2) was analyzed by recording the NADPH oxidation coupled to the reduction of GSSG to the  GSH form [47]. The GR reaction rate in the assays was corrected for the very small, nonenzymatic  oxidation of NADPH by GSSG. Guaiacol peroxidase (G‐POD; EC 1.11.1.7) activity was determined  by monitoring the guaiacol oxidation at 470 nm [48].  For  the  detection  of  SOD  (EC  1.15.1.1)  and  peroxidase  (POD)  isozymes,  nondenaturing  polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and specific staining methods were followed. Thus, SOD  isozymes  were  separated  on  10%  acrylamide  gels  and  visualized  in‐gel  by  the  photochemical  nitroblue  tetrazolium  (NBT)  reduction  method  [49].  Acromatic  bands  appeared  over  a  blue  background. To identify the different SOD isozymes, before staining preincubation of gels in the  presence of specific inhibitors, either 5 mM KCN or 5 mM H2O2, was carried out. Cyanide inhibits  copper zinc‐containing SODs (CuZn‐SODs), H2O2 inactivates CuZn‐SODs and iron‐containing SODs  (Fe‐SODs), and manganese‐containing SODs (Mn‐SODs) are resistant to both chemicals [50,51]. For  POD  isozymes,  8%  acrylamide  gels  were  prepared  and  the  in‐gel  activity  was  developed  by  immersing  gels  for  20  min  in  a  solution  (pH  5.5)  containing  0.1  M  sodium  acetate,  1  mM  3,3‐ diaminobenzidine (DAB) and 0.03% (v/v) H2O2 [52]. Band intensity of SOD and POD isozymes was  quantified using ImageJ 1.45 software (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA).  Protein  concentration  was  determined  by  the  method  of  Bradford  [53],  with  the  Bio‐Rad  (Hercules, California, USA) protein assay solution and bovine serum albumin as standard.  2.5. Detection and Quantification of Ascorbate, GSH and GSSG by Liquid Chromatography‐Electrospray  Mass Spectrometry (LC‐ES/MS)  Rice roots and shoots were ground under liquid N2 with the use of a mortar and a pestle. Then,  0.4 g from each powdered organ were suspended into 1 mL of 0.1 M HCl and centrifuged at 15,000g  for 20 min at 4 °C. Supernatants were filtered through 0.22 μm polyvinylidene fluoride filters and  immediately  analyzed,  with  all  procedures  performed  at  4  °C  and  protected  from  light  to  avoid  Agronomy 2020, 10, 1014  5  of  19  potential  degradation  of  the  analytes.  All  samples  were  analyzed  by  liquid  chromatography– electrospray/mass  spectrometry  (LC‐ES/MS) using an Allience 2695  HPLC  system  connected to a  Micromass Quattro micro API triple quadrupole mass spectrometer, both obtained from the Waters  Corporation (Milford, Massachusetts, USA). HPLC was carried out using an Atlantis  T3 3 μm 2.1 ×  100 mm Column obtained from the Waters Corporation. For the instrument control, data collection,  analysis and management, the MassLynx 4.1 software (Waters Corporation (Milford, Massachusetts,  USA)  package  was  used.  This  method  allowed  for  simultaneous  detection  and  quantification  of  ascorbate,  GSH,  and  GSSG  [54,55].  The  concentration  of  analytes  was  calculated  using  external  −1 standards and expressed as nmol g  of fresh weight (FW).  2.6. Other Assays  Lipid  peroxidation  was  estimated  by  measuring  the  concentration  of  MDA  through  the  thiobarbituric acid reacting substances (TBARS) method [56]. Nitric oxide (NO) was determined by  a  spectrofluorometric  assay  using  10 μM  4,5‐diaminofluorescein (4,5‐diaminofluorescein,  DAF‐2),  (Calbiochem , EMD Chemicals, San Diego, California, USA) as fluorescence probe and excitation and  emission  wavelengths  of  485  and  515  nm,  respectively  [57].  H2O2  was  detected  and  quantified  according to a peroxidase‐coupled assay using 4‐aminoantipyrine and phenol as donor substrates  [58].  2.7. Statistical Analysis  All data are means from three to five sets of independent experiments with three repetitions  each. In Figures 2–4 one‐way Anova was used for comparisons between means using the program  Statgraphics Centurion (Statgraphics.Net, Madrid, Spain). In Figures 5, 7 and 8, t‐Student was used  to  compare  data  from  As‐treated  plants  with  control  ones.  Asterisks  were  used  to  distinguish  significance levels, either p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) or p < 0.001 (***).  3. Results  As  an  approach  to  investigate  the  effect  of  AsV  on  the  ROS  metabolism  in  rice  plants,  a  preliminary  analysis  of  the  growth  parameters  under  different  As  (form  V)  concentrations  was  carried out. Figure 2A shows a representative image of the appearance of 26‐d‐old rice plants in the  six treatments followed in this work (0–200 μM). According to the visual analysis, a slight chlorosis  seems to be promoted by arsenic. As observed in Figure 2, As provoked a diminution of growth  parameters, from the lowest concentration used in this study (10 μM). This effect was clearer from  data on fresh weight (Figure 2B) than those on length (Figure 2C). Thus, the observed changes in  growth were basically due to the drastic effect exerted on shoot biomass and length, whereas the  roots were less affected.  Agronomy 2020, 10, 1014  6  of  19  Figure  2.  Effect  of  arsenate  (AsV)  on  26‐d‐old  rice  seedlings  grown  in  hydroponic  solutions  supplemented the last 12 days with different AsV concentrations. (A) Representative image of rice  seedlings at all As concentrations used in this work. (B) Plant biomass (g/plant). (C) Plant length  (cm/plant). Data are means ± SEM of at least three independent experiments. Different letters over the  columns for each organ (either whole plant, shoot or root) indicate that differences with respect to  control (0 μM AsV) values were statistically significant at p < 0.05.  The content of some macro‐ and micro‐nutrients was also analyzed. Thus, Figure 3 (panels A to  F) shows the K, P, S, Fe, Cu and Mn contents in roots and leaves of 26‐d‐old rice seedlings grown  under hydroponic conditions and exposed to 0, 10, 25, 50, 100 and 200 μM AsV during the last 12  days of the experiment. In roots, K content followed a progressive decrease as the AsV concentration  was  enhanced,  reaching  the  lowest  K  content  (55%)  at  an  AsV  concentration  of  200 μM.  This  micronutrient was unaffected in shoots (Figure 3A). Figure 3B shows the P content in rice roots and  shoots exposed to AsV, with values in roots lowering around 40% at AsV concentrations of 100–200  μM.  However, in the shoots the P content  was also  unaffected. Regarding  S content both organs  showed a progressive significant enhancement from AsV 25 μM, being 1.8‐fold higher in roots and  1.7‐fold in shoots at 200 μM As, compared to untreated plants (Figure 3C). Figure 3D illustrates the  Fe content which significantly increased from AsV 25 μM in roots, being 3.2‐fold higher in AsV of  200 μM. However, in shoots the Fe content was unaffected by AsV. Cu content decreased in both  organs but most drastically in roots (2.9‐fold lower at 200 μM AsV), rather than in shoots (2.0‐fold at  maximum AsV concentration) (Figure 3E). Figure 3F shows the Mn content, which had an irregular  and opposite behavior in both organs, since it only increased in roots at 200 μM AsV (1.8‐fold) but  lowered in shoots from 10 μM AsV up to 3.7 times.  Agronomy 2020, 10, 1014  7  of  19  Figure 3. Content of K, P, S, Fe, Cu and Mn in roots and shoots of 26‐d‐old rice seedlings grown in  hydroponic  solutions  supplemented  the  last  12  days  with  different  AsV  concentrations.  (A)  Potassium. (B) Phosphorus. (C) Sulfur (D) Iron. (F) Copper. (E) Manganese. Data are means ± SEM of  at least three independent experiments. Different letters over the columns for each organ (either shoot  or  root)  indicate  that  differences  with  respect  to  control  (0 μM  AsV)  values  were  statistically  significant at p < 0.05.  A global analysis of the above parameters on growth and mineral contents led us to set 50 μM  as the threshold concentration. The analysis of the As content in both roots and shoots at all assayed  As  concentrations  showed  that  the  metalloid  was  mostly  concentrated  in  roots,  although  at  the  highest concentration (200 μM), shoots displayed a fifth of the values obtained in roots (Figure 4). As  shown in Table 1, the TF indicated that As was transported from roots to shoots in parallel with the  As increasing concentrations in the nutrient solutions. Again, considering the data from both parts of  plants,  50 μM  AsV  was  the  level  from  which  this  parameter  displayed  the  clearest  changes.  Accordingly, this concentration of 50 μM was set to achieve further study of the effect of As on the  ROS  metabolism  of  rice.  For  that  purpose,  enzymatic  and  nonenzymatic  antioxidants  were  investigated.  Agronomy 2020, 10, 1014  8  of  19  Figure 4. Arsenic content in roots and shoots of 26‐d‐old rice seedlings grown in hydroponic solutions  supplemented the last 12 days with different AsV concentrations. Data are means ± SEM of at least  three independent experiments. DW, dry weight. Different letters over the columns for each organ  (either  shoot  or  root)  indicate  that  differences  with  respect  to  control  (0 μM  AsV)  values  were  statistically significant at p < 0.05.  Table 1. Translocation factor (TFroot to shoot) in 26‐d‐old rice seedlings grown in hydroponic solutions  supplemented with different AsV concentrations during the last 12 days. For the estimation of TF, the  following formula was applied, TFroot to shoot = [As shoot]/[As root].  Treatment (μM AsV) TF root to shoot 0 - 10 0.047 25 0.056 50 0.085 100 0.096 200 0.197 A battery of antioxidative enzymes, including catalase, those from the ascorbate–glutathione  cycle (AGC) APX, MDAR and GR, peroxidases and SOD was evaluated. As depicted in Figure 5A,  catalase  increased  in  both  roots  and  shoots  as  a  consequence  of  the  treatment  with  50 μM  AsV.  Interestingly, the other important H2O2‐scavenging enzyme in plant cells, the APX, behaved in an  opposite way, lowering its activity after the As treatment (Figure 5B). The other two enzymes of the  AGC, MDAR and GR, which use NAD(P)H and NADPH, respectively, to carry out their catalytic  reaction were only enhanced significantly in the aerial parts (Figure 5C,D). Guaiacol peroxidase (G‐ POD), another enzyme that consumes H2O2, increased significantly in roots, and no changes were  detected in shoots (Figure 5E)  Agronomy 2020, 10, 1014  9  of  19  Figure 5. Activity of diverse antioxidant enzymes in roots and shoots of 26‐d‐old rice seedlings grown  in hydroponic solutions supplemented the last 12 days without (control) and with 50 μM AsV. (A)  Catalase.  (B)  APX,  ascorbate  peroxidase.  (C)  MDAR,  monodehydroascorbate  reductase.  (D)  GR,  glutathione  reductase.  (E)  G‐POD,  guaiacol  peroxidase.  Data  are  means  ±  SEM  of  at  least  three  independent  experiments.  Asterisks  indicate  that  differences  with  respect  to  control  (0 μM  AsV)  values were statistically significant at p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***).  The isoenzyme pattern of SODs and peroxidases were achieved by nondenaturing PAGE and  the respective abundance of each isoenzyme was quantified by using the image analyzer software  ImageJ  (Figure  6).  Thus,  it  was  found  that  the  SOD  system  consisted  of  four  isoenzymes,  which  according  to  their  sensibility  to  the  specific  inhibitors  cyanide  and  H2O2  and  the  increasing  electrophoretic mobilities, were designated as  Mn‐SOD, Fe‐SOD, CuZn‐SOD I,  CuZn‐SOD II and  CuZn‐SOD III (Figure 6A). In control plants, the most abundant isozymes in the roots were Mn‐SOD  and CuZn‐SOD I, whereas in shoots both CuZn‐SOD I and CuZn‐SOD II showed the highest activities  and  the  Fe‐SOD  could  not  be  nearly  detected.  CuZn‐SOD  III  could  only  be  found  in  shoots.  No  significant changes on the SOD isoenzyme profiles were detected as the effect of As, excepting slight  decreases  of  Mn‐SOD  and  Fe‐SOD  in  roots  and  of  CuZn‐SOD  I  in  shoots,  along  with  a  little  enhancement of CuZn‐SOD III in shoots (Figure 6A). With respect to peroxidases, up to 7 isoenzymes  could  be  detected  after  specific  DAB‐staining  of  gels  which  were  designated  POD  1—POD  7  depending of their increasing electrophoretic mobilities (Figure 6B). POD 1, POD 2 and POD 4 were  present in roots, whereas the shoots contained all isozymes excepting POD 2. Neither qualitative nor  quantitative changes promoted by As treatment were observed in the isozyme pattern of roots. On  Agronomy 2020, 10, 1014  10  of  19  the contrary, in shoots POD 3 was induced by As while POD 1, 4, 6 and 7 were down‐regulated by  effect of the metalloid (Figure 6B).  Figure 6. Superoxide (SOD) and peroxidase (POD) isoenzyme activity in roots and shoots of 26‐d‐old  rice seedlings grown in hydroponic solutions supplemented the last 12 days without (control) and  with 50 μM AsV. (A) SOD. (B) POD. Isoenzymes were separated by nondenaturing PAGE in 10%  (SOD) and 8% (POD) acrylamide gels. Then, the respective in‐gel activity was detected by the NBT  reduction  method  and  the  DAB  oxidation  method,  respectively.  Isozymes  from  both  enzymatic  systems are depicted on the left of each panel. Similar protein amount (80 μg) per lane was loaded in  each  gel.  For  each  isoenzyme  profile,  a  representative  picture,  from  at  least  three  experiments,  is  shown. Relative quantification of band intensities was performed using the image analyzer software  ImageJ.  On the other hand, as indexes of the antioxidative capacity of both organs under As treatment,  two  of  the  most  powerful  and  abundant  cell  antioxidants  were  determined,  ascorbate,  and  glutathione  (reduced and oxidized  form).  Globally,  all these  compounds  were  more abundant in  shoots than in roots (Figure 7). The ascorbate content was enhanced by As in both organs (Figure 7A).  With  respect  to  GSH,  the  treatment  with  As  provoked  an  increase  in  the  aerial  part,  whilst  no  variation was observed in roots (Figure 7B). The behavior of GSSG was opposite in both roots and  shoots as a consequence of the metalloid effect. Thus, while As promoted a significant rise in roots,  this parameter lowered in shoots from As‐treated plants (Figure 7C). The redox reduced/oxidized  (GSH/GSSG) state of glutathione was determined. In roots, this ratio lowered from 51.0 under control   from 12.6 (control) to 30.8  conditions to 12.1 in As‐treated plants. Regarding shoots, this ratio rose (As).  Agronomy 2020, 10, 1014  11  of  19  Figure 7. Content of ascorbate and glutathione (reduced and oxidized) in roots and shoots of 26‐d‐ old rice seedlings grown in hydroponic solutions supplemented the last 12 days without (control) and  with 50 μM AsV. (A) Ascorbate. (B) Reduced glutathione (GSH). (C) Oxidized glutathione (GSSG).  Data  represent  the  mean  ±  SEM  of  at  least  three  different  experiments.  Asterisks  indicate  that  differences with respect to control (0 μM AsV) values were statistically significant at p < 0.05 (*), p <  0.01 (**) and p < 0.001 (***).  The content of two important signaling molecules (H2O2 and NO) in plant physiology were also  determined in these experiments. In all cases both species increased significantly due to the metalloid  (Figure  8A,B,  respectively).  Finally,  lipid  peroxidation,  a  known  index  of  oxidative  stress,  was  analyzed. It was shown that the formation of MDA species increased moderately, but significantly,  in both roots and shoots of plants subjected to As treatment (Figure 8C).  Figure 8. Levels of hydrogen peroxide, lipid peroxidation and nitric oxide in roots and shoots of 26‐ d‐old rice seedlings grown in hydroponic solutions supplemented the last 12 days without (control)  and with 50 μM AsV. (A) Hydrogen peroxide (H2O2) content. (B) Nitric oxide (NO) content. (C) Lipid  peroxidation level. Data represent the mean ± SEM of at least three different experiments. Asterisks  indicate that differences with respect to control (0 μM AsV) values were statistically significant at p <  0.05 (*), p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***).  4. Discussion  According to the analysis of the mineral content carried out in this work, it is remarkable that  the  root  was  the  organ  that  underwent  the  most  significant  differences  under  AsV‐stress,  with  reductions in the content of K, P and Cu whereas S, Fe and Mn increased. However, the content of  these minerals in shoots was less affected, with the rise of S content and the reduced content of Cu  and Mn being the most remarkable.  It has been thoroughly  reported that arsenic (As), either as AsIII  or AsV, provokes negative  effects in plant development with significant alterations at cellular, biochemical and molecular levels.  Thus, the most consensual mechanism by which As affects plant metabolism implies oxidative stress  events  [4,5,13,14,21–23,25,59,60].  Nevertheless,  the  sensitivity  to  and  the  response  against  As  can  significantly differ among plant species, among cultivars within the same species, between roots and  Agronomy 2020, 10, 1014  12  of  19  aerial parts in the same plant, but they also may depend on the concentration and the active form of  the  metalloid  (AsIII  or  AsV)  and  the  geographical  locations  [14,27,34,36,39,61–63].  Due  to  the  relevance at agronomical and economical levels and its wide distribution in some geographical areas,  rice (Oryza sativa) has been the major crop species where these studies have been achieved, with the  coincidence that rice grains, which are the nutritional basis for many countries worldwide, are able  to accumulate this metalloid, thus favoring the risk to transmit As to the human population and the  rest  of  the  food  chain  [64].  Up  until  today,  a  diversity  of  effects  of  As  on  the  physiology  and  metabolism of rice plants has been reported, but some gaps in the intimate mechanism of As toxicity  in  this  crop  are  still  unknown  due  to  the  diversity  of  interactions  with  metabolic  and  signaling  processes.  To perform our study, we initially used a wide range of arsenate concentrations (10–200 μM  AsV) to set the potential threshold at which the metalloid starts provoking significant effects. Arsenic  promoted a decrease in growth parameters just from the lowest concentration used, although it was  more significantly evident in fresh weight. This pattern agrees with previously reported data in this  plant  species  [28,31,37,62,65].  Additionally,  the  mineral  contents  of  K,  P,  S,  Fe,  Cu  and  Mn  was  analyzed  in  rice  seedlings  under  AsV  stress.  It  is  remarkable  that  the  root  was  the  organ  that  underwent the most prominent differences, with significant reductions in the content of K, P and Cu  whereas S, Fe and Mn increased due to As treatment. However, the content of these minerals in shoots  was less affected, with the increase of S content and the reduced content of Cu and Mn being the most  remarkable.  Taking  into  account  the  growth  parameters,  50 μM  AsV  was  considered  as  the  threshold  concentration to achieve our further research. It was also found that from this As concentration and  above, the metalloid was translocated to the aerial parts more efficiently, so it indicates that this was  the best concentration to follow the effects in the oxidative metabolism in shoots. The TFroot to shoot  values obtained in this work are mostly in the range reported before for rice (0.05‐1.43) [36], but above  most TFroot to shoot displayed by other species such as lettuce (Lactuca sativa), romaine lettuce (Lactuca  sativa var. longifolia), garlic (Allium sativum), water spinach (Ipomea aquatica), celery (Apium graveolens)  or pea (Pisum sativum), which showed values of 0.02–0.17 [4,66]. Although the obtained values in rice  indicate that most of the metalloid remains in the roots, the comparison with other species with lower  TFroot to shoot values might explain why As is accumulated in reproductive tissues (grains) which are  part of the aerial organs in this crop.  As in other plant species investigated so far, the main symptom in rice plants as a consequence  of high As concentrations is the induction of oxidative stress characterized by an alteration of the  antioxidative systems and increases of lipid peroxidation levels. This assertion is based on results  obtained from a diversity of experimental designs where As has been used as AsIII or AsV at different  concentrations and for various experimental lengths [5,28,29,31,33,37,60,62,65]. Our work establishes  a whole picture on how the main antioxidant systems (both enzymatic and nonenzymatic) respond  to a threshold (sub‐toxic) As concentration at both root and aerial parts after 12 d treatment.  Globally, roots and shoots displayed parallel activity patterns in all antioxidative enzymes. The  H2O2‐scavenging  enzymes  catalase  (CAT)  and  guaiacol  peroxidase  (G‐POD)  increased  in  both  organs, but with different profiles. Thus, whereas CAT showed greater augmentation in shoots, G‐ POD did in roots. Catalase is the main enzyme responsible for removing H2O2 in plants, and is mainly  relevant in photosynthetic tissues where, due to its high KM, in the mM range, it is able to decompose  important amounts of the ROS [67–71]. Regarding peroxidase, the pattern observed in both organs  by  determining the activity  spectrophotometrically differed  from the  isoenzyme  profile  observed  after nondenaturing PAGE. Thus, no changes were found in roots after As treatment, whereas the  metalloid greatly induced isozyme POD 3 in shoots. This points towards an important role of this  isozyme,  and  more  research  is  necessary  to  address  the  full  identification  and  nature  of  POD  3.  Recently, it has been reported that OsPRX38, a class HI peroxidase is upregulated under As stress in  rice.  This  isozyme  has  been  overexpressed  in  Arabidopsis  thaliana  enhancing  the  tolerance  of  the  mutants  to  As  and  this  was  accompanied  by  increased  SOD,  POD  and  glutathione‐S‐transferase  activities and lower H2O2 and malondialdehyde contents [72]. The POD isoenzyme pattern reported  Agronomy 2020, 10, 1014  13  of  19  here  differs  from  that  reported  earlier  where  only  four  less  defined  isozymes  were  detected.  Moreover, distinct AsV concentrations (100 and 500 μM) were used in such work [28].  Interestingly, APX, the enzyme which finely tunes the H2O2 level in cooperation with catalase  and peroxidases in plant cells, displayed an opposite behavior to these last enzymes in both organs,  with down regulated activity promoted by arsenic. It has been reported that rice contains a total of  eight APX isozymes present in the different subcellular compartments [73]. In this context, it has been  shown in cytosolic APX1 and APX2 double knockdown rice plants that abiotic stress promotes an  induction of POD activity to compensate the loss of APX [74]. This mechanism would allow keeping  the  appropriate  H2O2  levels  for  both  signaling  and  oxidative  protection.  This  trend  is  in  good  agreement with the observed increase of POD 3 activity in shoots under As stress. The profile of APX  activity  depicted  in  this  work  is  also  contrary  to  the  upregulating  effect  of  the  metalloid  on  the  ascorbate content. This antioxidant was greatly increased by As and this was more visible in shoots.  This opposite evolution of ascorbate and APX indicates that the AGC is possibly uncoupled and not  properly functioning due to the As. This eventuality is supported by the fact that the two other AGC  determined in this work (MDAR and GR) are upregulated by As in shoots. It could be explained in  two ways. On the one hand, both MDAR and GR might be implicated in the regeneration of ascorbate  once it has been oxidized by direct action over ROS, without the participation of the APX; on the  other hand, the GR activity may work independently to provide reduced GSH for other purposes  such as the synthesis of phytochelatins (PCs). The profile of the glutathione levels supports this last  assumption since the reduced form (GSH) shares the same tendency displayed by the GR activity.  The induction of the synthesis of PCs is a common event which is triggered by arsenic as it has been  demonstrated in several plant species [4,5,75–77] and also in rice [29,33,35,36]. Very recently, it has  been also reported that O. sativa L. cv. Dasan plants cultivated for 14 d in the presence of 15 μM AsIII  and sprayed with GSH reduced the oxidative stress promoted by arsenic, improved the antioxidant  defense systems through maintaining the redox homeostasis and increased the ascorbate and GSH  levels [65]. Nevertheless, the same authors also reported that, using the cultivar Dasan and the As  treatment reported above, the metalloid provoked a decrease in the ascorbate and GSH contents.  Therefore, this issue needs further research to better understand the dynamics of GSH in combination  with ascorbate and the AGC.  Regarding the SOD isozymes detected in nondenaturing PAGE, no qualitative differences were  promoted by AsV,  and only slight changes in the activity of the isozymes  were detected in both  organs. The isoenzymatic pattern obtained in this work is somehow different to the one reported  earlier by Shri and colleagues [28]. The cultivar, the growth and the As treatment conditions, besides  the preparation of samples and the electrophoresis handling, could be responsible of such differences.  The electrophoretic and staining resolution reported in the present work confirms that five SODs are  present in rice plants: one Mn‐SOD, one Fe‐SOD and three CuZn‐SODs (I, II and III). Both roots and  shoots share the isoenzymes Mn‐SOD, Fe‐SOD (very low abundance in shoots), CuZn‐SOD I and  CuZn‐SOD II, whereas CuZn‐SOD III could only be detected in the aerial parts. These differences in  the abundance and distribution of the SOD isozymes in both rice organs is not unusual, although it  has  been  observed  in  other  species  under  diverse  stress  situations  [50,78].  Thus,  in  14‐d‐old  Arabidopsis seedlings grown under in vitro conditions in the presence of 500 μM arsenate, one Mn‐ SOD,  one  Fe‐SOD  and  three  CuZn‐SODs  were  identified,  but  any  of  them  showed  significant  differences [22]. A similar behavior was observed in roots and leaves from 27‐day‐old Arabidopsis  plants grown in hydroponic conditions under 500 μM AsV where the SOD isozyme pattern showed  no  significant  changes  [24].  Likewise,  in  garlic  (Allium  sativum  L.)  plants  grown  in  hydroponic  conditions in the presence of AsV 200 μM, the SOD isoenzyme pattern in roots and shoots was also  unaffected  [4].  Nevertheless,  in  pea  plants  grown  under  AsV  50 μM  the  zymogram  was  quite  different. Thus, in roots from untreated plants, one Mn‐SOD and two CuZn‐SODs (I and II) were  identified,  while  in  leaves,  an  additional  Fe‐SOD  isozyme  was  detected.  Under  AsV  stress,  roots  showed a significant decrease of the different isozymes (70% of the Mn‐SOD, 36% of the CuZn‐SOD  I and 68% of the CuZn‐SOD II), while all leaf SOD isozymes were unaffected by AsV [19]. All these  data indicate that the antioxidant defense against As stress seems to be quite different depending on  Agronomy 2020, 10, 1014  14  of  19  the analyzed organs and the plant species, but it may also be affected by length of application, the  plant age, etc.  Two markers of oxidative stress were determined in this work, the H2O2 content and the lipid  peroxidation level. The increase of H2O2 in both organs as a consequence of the arsenic treatment  would  explain the  profile of  the  catalase  and  peroxidase  activities  referred to above.  This higher  content of H2O2 along with the slight increase of lipid peroxidation indicates that a mild oxidative  stress  seems  to  occur  under  the  AsV  concentration  used  in  our  study,  thus  suggesting  that  the  metabolic network from rice plants, under our experimental conditions, has the capacity to palliate  the oxidative stress which is usually associated with arsenic stress.  The profile followed by the H2O2 should be also viewed under the perspective of the nitric oxide  (NO) content observed after treatment with arsenic in both organs. NO is a gas radical with important  signaling and regulatory functions in plants. Thus, it has been demonstrated that NO is involved in  germination, development, senescence, and fruit ripening [79–82] and in the response against biotic  and  abiotic  stresses  [83–85].  It  has  been  found  that  the  application  of  exogenous  NO  provides  resistance to metal stress including cadmium [86] and aluminum [87], but also arsenic [88]. Thus, it  has been also reported that the treatment of Vicia faba with sodium nitroprusside (SNP), a NO donor,  improves the tolerance to arsenic (As) toxicity by increasing the antioxidant attributes of plants [89].  Likewise, the exogenous supplementation of SNP to Brassica juncea seedlings palliated the inhibitory  role of As‐III through the alteration of nutrients, amino acids and auxin redistribution [90]. In O. sativa  seedling  the  treatment  with  NO  in  combination  with  AsIII  diminished  the  accumulation  of  As,  improved the changes underwent by the root architecture, and reduced the ROS generation among,  other advantages [91]. At the cell/tissue levels, NO can interact with H2O2 [92], and this may allow  setting up a series of complex biochemical networks to help the plant responds against the arsenic  impact.  5. Conclusions and Future Prospects  Rice  grains  accumulate  arsenic  at  a  certain  level,  which  is  a  threat  for  a  huge  population,  especially for citizens living in Western Asia where this cereal is a major food and part of their daily  intake.  Arsenic  reduces  plant  growth  and  provokes  oxidative  stress  in  most  crops  of  agronomic  interest. Besides issuing and improving the policies against those practices that favor environmental  pollution (including direct soil contamination by As and through irrigation water), a good knowledge  on how the metabolism of the rice plant responds against the harm induced by As is elementary to  developing  biotechnological  strategies  to  alleviate  the  metalloid  effects.  Setting  the  threshold  concentration which triggers most of the metabolic responses provoked by As may help to devise  priming programs. Our results indicate that a mild oxidative stress occurs at 50 μM AsV and this  could be considered as the threshold concentration. Thus, under our experimental conditions, As‐ induced stress is accompanied by a differential response of the ROS metabolism between roots and  shoots.  The  enzymes  involved  in  the  H2O2  redox  homeostasis  are  the  most  significantly  affected  (catalase, APX and POD). A remarkable and significant induction of POD 3 in roots could compensate  for the loss of the APX activity in this organ.   Our data also provide evidence for a relevant role of NO in coordination with other signaling  molecules such as H2O2, as was also proposed elsewhere [93,94]. Therefore, due to its signaling and  regulatory potentialities, the development of biotechnological tools based on the NO biochemistry  could help to obtain plants with improved capacity to cope against As. This perspective can be also  combined with alternative proposals to alleviate As damage such as those which involve treatment  with the nontoxic selenium (Se) [8,39,40,95], salicylic acid, 24‐epi‐brassinolide and silicon [60], or even  leaf extracts from certain plants such as neem (Azadirachta indica) and Tulsi (Ocimum sanctum) [31].   Agronomy 2020, 10, 1014  15  of  19  Author  Contributions:  Performed  the  experimental  works,  E.S.;  participated  in  the  data  analyses,  S.G.‐G.;  designed  the  research,  discussed  the  data  and  participated  in  writing  the  manuscript,  J.M.P.  and  F.J.C.  All  authors have read and agreed to the published version of the manuscript.  Funding: This work was supported by ERDF‐cofinanced grants from the Ministry of Science and Innovation  (Recupera  2020‐20134R056  and  PID2019‐103924GB‐I00),  Junta  de  Andalucía  (group  BIO192),  and  CSIC  (COOPB20171), Spain.  Acknowledgments: The helpful assistance of the technicians Carmelo Ruiz Torres and María Jesús Campos is  acknowledged. LC‐ES/MS and mineral analyses were carried out at the Instrumental Technical Services of the  Estación Experimental del Zaidín (CSIC)  Conflicts of Interest: Authors declare no conflicts of interest.  References  1. Zhao, F.J.; McGrath, S.P.; Meharg, A.A. Arsenic as a food chain contaminant: Mechanisms of plant uptake  and metabolism and mitigation strategies. Annu. Rev. Plant Biol. 2010, 61, 535–559.  2. Sarkar,  A.;  Paul,  B.  The  global  menace  of  arsenic  and  its  conventional  remediation—A  critical  review.  Chemosphere 2016, 158, 37–49.  3. Clemens, S.; Ma, J.F. Toxic heavy metal and metalloid accumulation in crop plants and foods. Annu. Rev.  Plant Biol. 2016, 67, 489–512.  4. Ruiz‐Torres, C.; Feriche‐Linares, R.; Rodríguez‐Ruíz, M.; Palma, J.M.; Corpas, F.J. Arsenic‐induced stress  activates sulfur metabolism in different organs of garlic (Allium sativum L.) plants accompanied by a general  decline of the NADPH‐generating systems in roots. J. Plant Physiol. 2017, 211, 27–35.  5. Abbas, G.; Murtaza, B.; Bibi, I.; Shahid, M.; Niazi, N.K.; Khan, M.I.; Amjad, M.; Hussain, M.; Tahir, N.  Arsenic uptake, toxicity, detoxification, and speciation in plants: Physiological, biochemical, and molecular  aspects. Int. J. Environ. Res. Public Health 2018, 15, 59.  6. Rodríguez‐Ruiz, M.; Aparicio‐Chacón, M.V.; Palma, J.M.; Corpas, F.J. Arsenate disrupts ion balance, sulfur  and nitric oxide metabolisms in roots and leaves of pea (Pisum sativum L.) plants. Environ. Exp. Bot. 2019,  161, 143–156.  7. Alam, M.Z.; Hoque, M.A.; Ahammed, G.J.; McGee, R.; Carpenter‐Boggs, L. Arsenic accumulation in lentil  (Lens culinaris) genotypes and risk associated with the consumption of grains. Sci. Rep. 2019, 9, 9431.  8. Ali, W.; Zhang, H.; Junaid, M.; Mao, K.; Xu, N.; Chang, C.Y.; Rasool, A.; Aslam, M.; Ali, J.; Yang, Z.G.  Insights into the mechanisms of arsenic‐selenium interactions and the associated toxicity in plants, animals,  and humans: A critical review. Crit. Rev. Environ. Sci. Technol. 2020, doi:10.1080/10643389.2020.1740042.  9. Ventura‐Lima,  J.;  Bogo,  M.R.;  Monserrat,  J.M.  Arsenic  toxicity  in  mammals  and  aquatic  animals:  A  comparative biochemical approach. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2011, 74, 211–218.  10. Abdul, K.S.; Jayasinghe, S.S.; Chandana, E.P.; Jayasumana, C.; De Silva, P.M. Arsenic and human health  effects: A review. Environ. Toxicol. Pharmacol. 2015, 40, 828–846.  11. Escudero‐Lourdes, C. Toxicity mechanisms of arsenic that are shared with neurodegenerative diseases and  cognitive impairment: Role of oxidative stress and inflammatory responses. Neurotoxicology 2016, 53, 223– 235.  12. Palma‐Lara,  I.;  Martínez‐Castillo,  M.;  Quintana‐Pérez,  J.C.;  Arellano‐Mendoza,  M.G.;  Tamay‐Cach,  F.;  Valenzuela‐Limón, O.L.; García‐Montalvo, E.A.; Hernández‐Zavala, A. Arsenic exposure: A public health  problem leading to several cancers. Regul. Toxicol. Pharmacol. 2020, 110, doi: 10.1016/j.yrtph.2019.104539.  13. Islam, E.; Khan, M.T.; Irem, S. Biochemical mechanisms of signaling: Perspectives in plants under arsenic  stress. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2015, 114, 126–133.  14. Abedi, T.; Mojiri, A. Arsenic uptake and accumulation mechanisms in rice species. Plant 2020, 9, 129.  15. Song, W.Y.; Mendoza‐Cózatl, D.G.; Lee, Y.; Schroeder, J.I.; Ahn, S.N.; Lee, H.S.; Wicker, T.; Martinoia, E.  Phytochelatin‐metal(loid)  transport  into  vacuoles  shows  different  substrate  preferences  in  barley  and  Arabidopsis. Plant Cell Environ. 2014, 37, 1192–1201.  16. Tang,  Z.;  Chen,  Y.;  Miller,  A.J.;  Zhao,  F.J.  The  C‐type  ATP‐binding  cassette  transporter  OsABCC7  is  involved in the root‐to‐shoot translocation of arsenic in rice. Plant Cell Physiol. 2019, 60, 1525–1535.  17. Schmöger, M.E.; Oven, M.; Grill, E. Detoxification of arsenic by phytochelatins in plants. Plant Physiol. 2000,  122, 793–801.  Agronomy 2020, 10, 1014  16  of  19  18. Lee, D.A.; Chen, A.; Schroeder, J.I. ars1, an Arabidopsis mutant exhibiting increased tolerance to arsenate  and increased phosphate uptake. Plant J. 2003, 35, 637–646.  19. Quaghebeur,  M.;  Rengel,  Z.  Arsenic  uptake,  translocation  and  speciation  in  pho1  and  pho2  mutants  of  Arabidopsis thaliana. Physiol. Plant. 2004, 120, 280–286.  20. Li,  Y.;  Dhankher,  O.P.;  Carreira,  L.;  Lee,  D.;  Chen,  A.;  Schroeder,  J.I.;  Balish,  R.S.;  Meagher,  R.B.  Overexpression  of  phytochelatin  synthase  in  Arabidopsis  leads  to  enhanced  arsenic  tolerance  and  cadmium hypersensitivity. Plant Cell Physiol. 2004, 45, 1787–1797.  21. Bienert, G.P.; Jahn, T.P. Major intrinsic proteins and arsenic transport in plants: New players and their  potential role. Adv. Exp. Med. Biol. 2010, 679, 111–125.  22. Leterrier, M.; Airaki, M.; Palma, J.M.; Chaki, M.; Barroso, J.B.; Corpas, F.J. Arsenic triggers the nitric oxide  (NO) and S‐nitrosoglutathione (GSNO) metabolism in Arabidopsis. Environ. Pollut. 2012, 166, 136–143.  23. Leterrier,  M.;  Barroso,  J.B.;  Palma,  J.M.;  Corpas,  F.J.  Cytosolic  NADP‐isocitrate  dehydrogenase  in  Arabidopsis leaves and roots. Biol. Plant. 2012, 56, 705–710.  24. Corpas, F.J.; Aguayo‐Trinidad, S.; Ogawa, T.; Yoshimura, K.; Shigeoka, S. Activation of NADPH‐recycling  systems in leaves and roots of Arabidopsis thaliana under arsenic‐induced stress conditions is accelerated by  knock‐out of Nudix hydrolase 19 (AtNUDX19) gene. J. Plant Physiol. 2016, 192, 81–89.  25. Park, J.H.; Han, Y.S.; Seong, H.J.; Ahn, J.S.; Nam, I.H. Arsenic uptake and speciation in Arabidopsis thaliana  under hydroponic conditions. Chemosphere 2016, 154, 283–288.  26. Finnegan, P.M.; Chen, W. Arsenic toxicity: The effects on plant metabolism. Front. Physiol. 2012, 3, 182.  27. Kofroňová, M.; Hrdinová, A.; Mašková, P.; Tremlová, J.; Soudek, P.; Petrová, S.; Pinkas, D.; Lipavská, H.  Multi‐Component  antioxidative  system  and  robust  carbohydrate  status,  the  essence  of  plant  arsenic  tolerance. Antioxidants 2020, 9, 283.  28. Shri, M.; Kumar, S.; Chakrabarty, D.; Trivedi, P.K.; Mallick, S.; Misra, P.; Shukla, D.; Mishra, S.; Srivastava,  S.;  Tripathi,  R.D.;  et  al.  Effect  of  arsenic  on  growth,  oxidative  stress,  and  antioxidant  system  in  rice  seedlings. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2009, 72, 1102–1110.  29. Dave, R.; Tripathi, R.D.; Dwivedi, S.; Tripathi, P.; Dixit, G.; Sharma, Y.K.; Trivedi, P.K.; Corpas, F.J.; Barroso,  J.B.; Chakrabarty, D. Arsenate and arsenite exposure modulate antioxidants and amino acids in contrasting  arsenic accumulating rice (Oryza sativa L.) genotypes. J. Hazard. Mater. 2013, 262, 1123–1131.  30. Farooq, M.A.; Li, L.; Ali, B.; Gill, R.A.; Wang, J.; Ali, S.; Gill, M.B.; Zhou, W. Oxidative injury and antioxidant  enzymes regulation in arsenic‐exposed seedlings of four Brassica napus L. cultivars. Environ. Sci. Pollut. Res.  Int. 2015, 22, 10699–10712.  31. Gautam, A.; Pandey, A.K.; Dubey, R.S. Azadirachta indica and Ocimum sanctum leaf extracts alleviate arsenic  toxicity by reducing arsenic uptake and improving antioxidant system in rice seedlings. Physiol. Mol. Biol.  Plants 2020, 26, 63–81.  32. Duan, G.; Liu, W.; Chen, X.; Hu, Y.; Zhu, Y. Association of arsenic with nutrient elements in rice plants.  Metallomics 2013, 5, 784–792.  33. Dave, R.; Singh, P.K.; Tripathi, P.; Shri, M.; Dixit, G.; Dwivedi, S.; Chakrabarty, D.; Trivedi, P.K.; Sharma,  Y.K.; Dhankher, O.P.; et al. Arsenite tolerance is related to proportional thiolic metabolite synthesis in rice  (Oryza sativa L.). Arch. Environ. Contam. Toxicol. 2013, 64, 235–242.  34. Lei, M.; Tie, B.; Zeng, M.; Qing, P.; Song, Z.; Williams, P.N.; Huang, Y. An arsenic‐contaminated field trial  to assess the uptake and translocation of arsenic by genotypes of rice. Environ. Geochem. Health 2013, 35,  379–390.  35. Tripathi, P.; Tripathi, R.D.; Singh, R.P.; Dwivedi, S.; Chakrabarty, D.; Trivedi, P.K.; Adhikari, B. Arsenite  tolerance in rice (Oryza sativa L.) involves coordinated role of metabolic pathways of thiols and amino acids.  Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 2013, 20, 884–896.  36. Batista, B.L.; Nigar, M.; Mestrot, A.; Rocha, B.A.; Barbosa Junior, F.; Price, A.H.; Raab, A.; Feldmann, J.  Identification  and  quantification  of  phytochelatins  in  roots  of  rice  to  long‐term  exposure:  Evidence  of  individual role on arsenic accumulation and translocation. J. Exp. Bot. 2014, 65, 1467–1479.  37. Begum,  M.C.;  Islam,  M.S.;  Islam,  M.;  Amin,  R.;  Parvez,  M.S.;  Kabir,  A.H.  Biochemical  and  molecular  responses underlying differential arsenic tolerance in rice (Oryza sativa L.). Plant Physiol. Biochem. 2016, 104,  266–277.  38. Chen,  Y.;  Han,  Y.H.;  Cao,  Y.;  Zhu,  Y.G.;  Rathinasabapathi,  B.;  Ma,  L.Q.  Arsenic  transport  in  rice  and  biological solutions to reduce arsenic risk from rice. Front Plant Sci. 2017, 8, 268.  Agronomy 2020, 10, 1014  17  of  19  39. Kalita,  J.;  Pradhan,  A.K.;  Shandilya,  Z.M.;  Tanti,  B.  Arsenic  stress  responses  and  tolerance  in  rice:  Physiological, cellular and molecular approaches. Rice Sci. 2018, 25, 235–249.  40. Singh,  R.;  Upadhyay,  A.K.;  Singh,  D.P.  Regulation  of  oxidative  stress  and  mineral  nutrient  status  by  selenium in arsenic treated crop plant Oryza sativa. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2018, 148, 105–113.  41. Corpas, F.J.; González‐Gordo, S.; Cañas, A.; Palma, J.M. Nitric oxide and hydrogen sulfide in plants: Which  comes first? J. Exp. Bot. 2019, 70, 4391–4404.  42. Palma, J.M.; Freschi, L.; Rodríguez‐Ruiz, M.; González‐Gordo, S.; Corpas, F.J. Nitric oxide in the physiology  and quality of fleshy fruits. J. Exp. Bot. 2019, 70, 4405–4417.  43. Miyake, C.; Asada, K. Inactivation mechanism of ascorbate peroxidase at low concentrations of ascorbate:  Hydrogen peroxide decomposes compound I of ascorbate peroxidase. Plant Cell Physiol. 1996, 36, 661–668.  44. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 1984, 105, 121–126.  45. Hossain, M.A.; Asada, K. Inactivation of ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts on dark addition of  hydrogen peroxide: Its protection by ascorbate. Plant Cell Physiol. 1984, 25, 1285–1295.  46. Hossain,  M.A.;  Nakano,  Y.;  Asada,  K.  Monodehydroascorbate  reductase  in spinach  chloroplast  and  its  participation in regeneration of ascorbate for scavenging of hydrogen peroxide. Plant Cell Physiol. 1984, 25,  385–395.  47. Edwards, E.A.; Rawsthone, S.; Mullineaux, p.M. Subcellular distribution ofmultiple forms of glutathione  reductase in leaves of pea (Pisum sativum L.). Planta 1990, 180, 278–284.  48. Quessada,  M.P.;  Macheix,  J.J.  Caractérisation  d’une  peroxydase  impliquée  spécifiquement  dans  la  lignification, en relation avec l’incompatibilité au greffage chez l’Abricotier. Physiol. Végét. 1984, 22, 533– 540.  49. Beauchamp,  C.;  Fridovich,  I.  Superoxide  dismutase:  Improved  assays  and  an  assay  applicable  to  acrylamide gels. Anal. Biochem. 1971, 44, 276–287.  50. Houmani,  H.;  Rodríguez‐Ruiz,  M.;  Palma,  J.M.;  Abdelly,  C.;  Corpas,  F.J.  Modulation  of  superoxide  dismutase  (SOD)  isozymes  by  organ  development  and  high  long‐term  salinity  in  the  halophyte  Cakile  maritima. Protoplasma 2016, 253, 885–894.  51. Pinilla, M.; Iglesias‐Moya, J.; Campos, M.J.; Corpas, F.J.; Palma, J.M. Pomegranate (Punica  granatum L.)  Fruits: Characterization of the main enzymatic antioxidants (peroxisomal catalase and SOD isozymes) and  the NADPH‐regenerating system. Agronomy 2019, 9, 338.  52. Ádám,  A.L.;  Bestwick,  C.S.;  Barna,  B.;  Mansfield,  J.W.  Enzymes  regulating  the  accumulation  of  active  oxygen species during the hypersensitive reaction of bean to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Planta  1995, 197, 240–249.  53. Bradford,  M.M.  A  rapid  and  sensitive  method  for  the  quantitation  of  microgram  quantities  of  protein  utilizing the principle of protein‐dye binding. Anal. Biochem. 1976, 72, 248–254.  54. Airaki,  M.;  Sánchez‐Moreno,  L.;  Leterrier,  M.;  Barroso,  J.B.;  Palma,  J.M.;  Corpas,  F.J.  Detection  and  quantification of S‐nitrosoglutathione (GSNO) in pepper (Capsicum annuum L.) plant organs by LC‐ES/MS.  Plant Cell Physiol. 2011, 52, 2006–2015.  55. Rodríguez‐Ruiz,  M.;  Mateos,  R.M.;  Codesido,  V.;  Corpas,  F.J.;  Palma,  J.M.  Characterization  of  the  galactono‐1,4‐lactone dehydrogenase from pepper fruits and its modulation in the ascorbate biosynthesis.  Role of nitric oxide. Redox Biol. 2017, 12, 171–181.  56. Buege, J.A.; Aust, S.D. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 1978, 52, 302–310.  57. Chaki, M.; Álvarez de Morales, P.; Ruiz, C.; Begara‐Morales, J.C.; Barroso, J.B.; Corpas, F.J.; Palma, J.M.  Ripening  of  pepper  (Capsicum  annuum)  fruit  is  characterized  by  an  enhancement  of  protein  tyrosine  nitration. Ann. Bot. 2015, 116, 637–647.  58. Palma,  J.M.;  Garrido,  M.;  Rodríguez‐García,  M.I.;  del  Río,  L.A.  Peroxisome  proliferation  and  oxidative  stress mediated by activated oxygen species in plant peroxisomes. Arch. Biochem. Biophys. 1991, 287, 68–74.  59. Chandrakar,  V.;  Naithani,  S.C.;  Keshavkant,  S.  Arsenic‐induced  metabolic  disturbances  and  their  mitigation mechanisms in crop plants: A review. Biologia 2016, 71, 367–377.  60. Maghsoudi, K.; Arvin, M.J.; Ashraf, M. Mitigation of arsenic toxicity in wheat by the exogenously applied  salicylic acid, 24‐epi‐brassinolide and silicon. J. Soil Sci. Plant Nutr. 2020, 2, 577–588.  61. Kumarathilaka, P.; Seneweera, S.; Meharg, A.; Bundschuh, J. Arsenic speciation dynamics in paddy rice  soil‐water environment: Sources, physico‐chemical, and biological factors—A review. Water Res. 2018, 140,  403–414.  Agronomy 2020, 10, 1014  18  of  19  62. Majumder,  B.;  Das,  S.;  Mukhopadhyay,  S.;  Biswas,  A.K.  Identification  of  arsenic‐tolerant  and  arsenic‐ sensitive  rice (Oryza  sativa L.)  cultivars on  the basis of arsenic  accumulation assisted  stress  perception,  morpho‐biochemical responses, and alteration in genomic template stability. Protoplasma 2019, 256, 193– 211.  63. Otero, X.L.; Atiaga, O.; Estrella, R.; Tierra, W.; Ruales, J.; Zayas, L.; Souza, V., Jr.; Ferreira, T.O.; Nóbrega,  G.N.; Oliveira, D.P.; et al. Geographical variations in arsenic contents in rice plants from Latin America and  the Iberian Peninsula in relation to soil conditions. Environ. Geochem. Health 2020, doi:10.1007/s10653‐020‐ 00581‐8.  64. Chowdhury, N.R.; Das, A.; Joardar, M.; De, A.; Mridha, D.; Das, R.; Rahman, M.M.; Roychowdhury, T.  Flow of arsenic between rice grain and water: Its interaction, accumulation and distribution in different  fractions of cooked rice. Sci. Total Environ. 2020, 731,138937.  65. Jung, H.I.; Kong, M.S.; Lee, B.R.; Kim, T.H.; Chae, M.J.; Lee, E.J.; Jung, G.B.; Lee, C.H.; Sung, J.K.; Kim, Y.H.  Exogenous glutathione increases arsenic translocation into shoots and alleviates arsenic‐induced oxidative  stress by sustaining ascorbate‐glutathione homeostasis in rice seedlings. Front. Plant Sci. 2019, 10, 1089.  66. Kumwimba,  M.N.;  Zeng,  X.;  Bai,  L.;  Wang,  J.  A  preliminary  study  on  genetic  variation  of  arsenic  concentration in 32 different genotypes of leafy vegetable. Environ. Pollut. 2014, 3, 72–87.  67. Mhamdi, A.; Queval, G.; Chaouch, S.; Vanderauwera, S.; Van Breusegem, F. Catalase function in plants: A  focus on Arabidopsis mutants as stress‐mimic models. J. Exp. Bot. 2010, 61, 4198–4220.  68. Mhamdi, A.; Noctor, G.; Baker, A. Plant catalases: Peroxisomal redox guardians. Arch. Biochem. Biophys.  2012, 525, 1–194.  69. Anjum,  N.A.;  Sharma,  P.;  Gill,  S.S.;  Hasanuzzaman,  M.;  Khan,  E.A.;  Kachhap,  K.;  Mohamed,  A.A.;  Thangavel, P.; Devi, G.D.; Vasudhevan, P.; et al. Catalase and ascorbate peroxidase‐representative H2O2‐ detoxifying heme enzymes in plants. Environ. Sci. Pollut. Res. 2016, 23, 19002–19029.  70. Rodríguez‐Ruiz, M.; González‐Gordo, S.; Cañas, A.; Campos, M.J.; Paradela, A.; Corpas, F.J.; Palma, J.M.  Sweet pepper (Capsicum annuum L.) fruits contain an atypical peroxisomal catalase that is modulated by  reactive oxygen and nitrogen species. Antioxidants 2019, 8, 374.  71. Palma, J.M.; Mateos, R.M.; López‐Jaramillo, J.; Rodríguez‐Ruiz, M.; González‐Gordo, S.; Lechuga‐Sancho,  A.M.; Corpas, F.J. Plant catalases as NO and H2S targets. Redox Biol. 2020, 34, 101525.  72. Kidwai, M.; Dhar, Y.V.; Gautam, N.; Tiwari, M.; Ahmad, I.Z.; Asif, M.H.; Chakrabarty, D. Oryza sativa class  HI  peroxidase  (OsPRX38)  overexpression  in  Arabidopsis  thaliana  reduces  arsenic  accumulation  due  to  apoplastic lignification. J. Hazard. Mat. 2019, 362, 383–393.  73. Teixeira,  F.K.;  Menezes‐Benavente,  L.;  Margis,  R.;  Margis‐Pinheiro,  M.  Analysis  of  the  molecular  evolutionary history of the ascorbate peroxidase gene family: Inferences from the rice genome. J. Mol. Evol.  2004, 59, 761–770.  74. Bonifacio, A.; Martins, M.O.; Ribeiro, C.W.; Fontenele, A.V.; Carvalho, F.E.; Margis‐Pinheiro, M.; Silveira,  J.A. Role of peroxidases in the compensation of cytosolic ascorbate peroxidase knockdown in rice plants  under abiotic stress. Plant Cell Environ. 2011, 34, 1705–1722.  75. Gupta, D.K.; Tripathi, R.D.; Mishra, S.; Srivastava, S.; Dwivedi, S.; Rai, U.N.; Yang, X.E.; Huanji, H.; Inouhe,  M. Arsenic accumulation in root and shoot vis‐a‐visits effects on growth and level of phytochelatins in  seedlings of Cicer arietinum L. J. Environ. Biol. 2008, 29, 281–286.  76. Kim, D.Y.; Park, H.; Lee, S.H.; Koo, N.; Kim, J.G. Arsenate tolerance mechanism of Oenothera odorata from  a mine population involves the induction of phytochelatins in roots. Chemosphere 2009, 75, 505–512.  77. Zhang, H.; Xu, W.; Guo, J.; He, Z.; Ma, M. Coordinated responses of phytochelatins and metallothioneins  to heavy metals in garlic seedlings. Plant Sci. 2005, 169, 1059–1065.  78. del Río, L.A.; Corpas, F.J.; López‐Huertas, E.; Palma, J.M. Plant superoxide dismutases: Function under  abiotic stress conditions. In Antioxidants and Antioxidant Enzymes in Higher Plants; Gupta, D.K., Palma, J.M.,  Corpas, F.J., Eds.; Springer International Publishing: Cham, Switzerland, 2018; pp. 1–26.  79. Yu,  M.;  Lamattina,  L.;  Spoel,  S.H.;  Loake,  G.J.  Nitric  oxide  function  in  plant  biology:  A  redox  cue  in  deconvolution. New Phytol. 2014, 202, 1142–1156.  80. Corpas, F.J.; Palma, J.M. Nitric oxide on/off in fruit ripening. Plant Biol. (Stuttg.) 2018, 20, 805–807.  81. Takahashi,  M.;  Morikawa,  H.  Nitrate,  but  not  nitrite,  derived  from  nitrogen  dioxide  accumulates  in  Arabidopsis  leaves  following  exposure  to  N‐labeled  nitrogen  dioxide.  Plant  Signal.  Behav.  2019,  14,  1559579.  Agronomy 2020, 10, 1014  19  of  19  82. Kolbert, Z.; Barroso, J.B.; Brouquisse, R.; Corpas, F.J.; Gupta, K.J.; Lindermayr, C.; Loake, G.J.; Palma, J.M.;  Petřivalský, M.; Wendehenne, D.; et al. A forty year journey: The generation and roles of NO in plants.  Nitric Oxide 2019, 93, 53–70.  83. Chaki,  M.;  Fernández‐Ocaña,  A.M.;  Valderrama,  R.;  Carreras,  A.;  Esteban,  F.J.;  Luque,  F.;  Gómez‐ Rodríguez,  M.V.;  Begara‐Morales,  J.C.;  Corpas,  F.J.;  Barroso,  J.B.  Involvement  of  reactive  nitrogen  and  oxygen species (RNS and ROS) in sunflower‐mildew interaction. Plant Cell Physiol. 2009, 50, 265–279.  84. León, J.; Castillo, M.C.; Coego, A.; Lozano‐Juste, J.; Mir, R. Diverse functional interactions between nitric  oxide and abscisic acid in plant development and responses to stress. J. Exp. Bot. 2014, 65, 907–921.  85. Houmani, H.; Rodríguez‐Ruiz, M.; Palma, J.M.; Corpas, F.J. Mechanical wounding promotes local and long  distance  response  in  the  halophyte  Cakile  maritima  through  the  involvement  of  the  ROS  and  RNS  metabolism. Nitric Oxide 2018, 74, 93–101.  86. Laspina, N.V.; Groppa, M.D.; Tomaro, M.L.; Benavides, M.P. Nitric oxide protects sunflower leaves against  Cd‐induced oxidative stress. Plant Sci. 2005, 169, 323–330.  87. Wang, Y.S.; Yang, Z.M. Nitric oxide reduces aluminum toxicity by preventing oxidative stress in the roots  of Cassia tora L. Plant Cell Physiol. 2005, 46, 1915–1923.  88. Singh,  A.P.;  Dixit,  G.;  Kumar,  A.;  Mishra,  S.;  Singh,  P.K.;  Dwivedi,  S.;  Trivedi,  P.K.;  Chakrabarty,  D.;  Mallick, S.; Pandey, V.; et al. Nitric oxide alleviated arsenic toxicity by modulation of antioxidants and thiol  metabolism in rice (Oryza sativa L.). Front. Plant Sci. 2016, 6, 1272.  89. Ahmad, P.; Alam, P.; Balawi, T.H.; Altalayan, F.H.; Ahanger, M.A.; Ashraf, A. Sodium nitroprusside (SNP)  improves tolerance to arsenic (As) toxicity in Vicia faba through the modifications of biochemical attributes,  antioxidants, ascorbate‐glutathione cycle and glyoxalase cycle. Chemosphere 2020, 244, 125480.  90. Praveen, A.; Pandey, A.; Gupta, M. Nitric oxide alters nitrogen metabolism and PIN gene expressions by  playing protective role in arsenic challenged Brassica juncea L. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2019, 176, 95–107.  91. Praveen, A.; Gupta, M. Nitric  oxide  confronts arsenic stimulated  oxidative  stress and  root architecture  through distinct gene expression of auxin transporters, nutrient related genes and modulates biochemical  responses in Oryza sativa L. Environ. Pollut. 2018, 240, 950–962.  92. Gupta, D.K.; Palma, J.M.; Corpas, F.J. (Eds.) Nitric Oxide and Hydrogen Peroxide in Higher Plants; Springer  Nature Switzerland AG: Cham, Switzerland, 2019.  93. Terrón‐Camero, L.C.; Peláez‐Vico, M.A.; Del‐Val, C.; Sandalio, L.M.; Romero‐Puertas, M.C. Role of nitric  oxide in plant responses to heavy metal stress: Exogenous application versus endogenous production. J.  Exp. Bot. 2019, 70, 4477–4488.  94. Piacentini, D.; Corpas, F.J.; D’Angeli, S.; Altamura, M.M.; Falasca, G. Cadmium and arsenic‐induced‐stress  differentially modulates Arabidopsis root architecture, peroxisome distribution, enzymatic activities and  their nitric oxide content. Plant Physiol. Biochem. 2020, 148, 312–323.  95. Camara, A.Y.; Wan, Y.N.; Yu, Y.; Wang, Q.; Wang, K.; Li, H.F. Effect of endogenous selenium on arsenic  uptake and antioxidative enzymes in as‐exposed rice seedlings. Int. J. Environ. Res. Public Health 2019, 16,  3350.  © 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access  article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution  (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 

Journal

AgronomyMultidisciplinary Digital Publishing Institute

Published: Jul 14, 2020

There are no references for this article.