Get 20M+ Full-Text Papers For Less Than $1.50/day. Start a 14-Day Trial for You or Your Team.

Learn More →

Effects of Dietary Fishmeal Replacement by Poultry By-Product Meal and Hydrolyzed Feather Meal on Liver and Intestinal Histomorphology and on Intestinal Microbiota of Gilthead Seabream (Sparus aurata)

Effects of Dietary Fishmeal Replacement by Poultry By-Product Meal and Hydrolyzed Feather Meal on... Article  Effects of Dietary Fishmeal Replacement by Poultry by‐Product  Meal and Hydrolyzed Feather Meal on Liver and Intestinal   Histomorphology and on Intestinal Microbiota of Gilthead   Seabream (Sparus aurata)  1 1 1, 1,2 1 Pier Psofakis  , Alexandra Meziti  , Panagiotis Berillis  *, Eleni Mente  , Konstantinos A. Kormas     1, and Ioannis T. Karapanagiotidis *    Department of Ichthyology and Aquatic Environment, School of Agricultural Sciences, University of  Thessaly, Fytoko Street, 38446 Volos, Greece; psofakis@uth.gr (P.P.); ameziti@gmail.com (A.M.);  emente@uth.gr (E.M.); kkormas@uth.gr (K.A.K.)    Laboratory of Ichthyology–Culture and Pathology of Aquatic Animals, School of Veterinary Medicine,  Aristotle University of Thessaloniki, University Campus, 54006 Thessaloniki, Greece  *  Correspondence: pveril@uth.gr (P.B.); ikarapan@uth.gr (I.T.K.)  Featured Application: Poultry  by‐product meal  and hydrolyzed feather  meal can successfully  replace fishmeal at low dietary levels in feeds for farmed gilthead seabream and thus enhance  the environmental and economic sustainability of its production.  Citation: Psofakis, P.; Meziti, A.;  Abstract:  The  effects  on  liver  and  intestinal  histomorphology  and  on  intestinal  microbiota  in  Berillis, P.; Mente, E.; Kormas, K.A.;  gilthead  seabream  (Sparus  aurata)  fed  diets  that  contained  poultry  by‐product  meal  (PBM)  and  Karapanagiotidis, I.T. Effects of Dietary  hydrolyzed  feather  meal  (HFM)  as  fishmeal  replacements  were  studied.  Fish  fed  on  a  series  of  Fishmeal Replacement by Poultry by‐ isonitrogenous  and  isoenergetic  diets,  where  fishmeal  protein  of the  control  diet  (FM  diet)  was  Product Meal and Hydrolyzed Feather  Meal on Liver and Intestinal  replaced by either PBM or by HFM at 25%, 50% and 100% without amino acid supplementation  Histomorphology and on Intestinal  (PBM25, PBM50, PBM100, HFM25, HFM50 and HFM100 diets) or supplemented with lysine and  Microbiota of Gilthead Seabream  methionine (PBM25+, PBM50+, HFM25+  and HFM50+  diets). The  use of  PBM and  HFM  at  25%  (Sparus aurata). Appl. Sci. 2021, 11, 8806.  fishmeal replacement generated a similar hepatic histomorphology to FM‐fed fish, indicating that  https://doi.org/10.3390/app11198806  both land animal proteins are highly digestible at low FM replacement levels. However, 50% and  100% FM replacement levels by either PBM or HFM resulted in pronounced hepatic alterations in  Academic Editor: Simona Picchietti  fish  with  the  latter  causing  more  severe  degradation  of  the  liver.  Dietary  amino  acid  supplementation delivered an improved tissue histology signifying their importance at high FM  Received: 28 July 2021  replacement levels. Intestinal microbiota was dominated by Proteobacteria (58.8%) and Actinobacteria  Accepted: 16 September 2021  (32.4%) in all dietary groups, but no specific pattern was observed among them at any taxonomic  Published: 22 September 2021  level. This finding was probably driven by the high inter‐individual variability observed.  Publisher’s  Note:  MDPI  stays  Keywords: nutrition; aquaculture; fishmeal replacement; land animal proteins; histology; intestinal  neutral with  regard  to jurisdictional  claims  in  published  maps  and  microbiota; Sparus aurata  institutional affiliations.  1. Introduction  Copyright:  ©  2021  by  the  authors.  Gilthead seabream (Sparus aurata) is one of the most important carnivorous farmed  Licensee  MDPI,  Basel,  Switzerland.  fish species in European aquaculture with an annual production of approximately 186,000  This article  is an open access article  mt [1]. As aquaculture is becoming the major fish‐food production sector [2] there is a  distributed  under  the  terms  and  search  for  suitable  protein  sources  in  aquafeeds  that  are  alternatives  to  fishmeal  to  conditions of the Creative Commons  enhance its environmental and economic sustainability. Fishmeal was, and in many cases  Attribution  (CC  BY)  license  remains  the  primary  protein  source  for  the  nutrition  of  farmed  fish.  However,  it  has  (http://creativecommons.org/licenses /by/4.0/).  become necessary to use low fishmeal diets because the global availability of fishmeal is  Appl. Sci. 2021, 11, 8806. https://doi.org/10.3390/app11198806  www.mdpi.com/journal/applsci  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  2  of  15  stagnant, especially for those sourced from the wild, and its price has increased [3]. Land  animal proteins, such as hydrolyzed feather meal (HFM) and poultry by‐product meal  (PBM) are currently incorporated in European aquafeeds. After their re‐approval in 2013,  proved to be valuable feedstuffs for dietary fishmeal replacement in the diet of most fish  species [4–6], including gilthead seabream [7,8]. Although the poultry sector is responsible  for a substantial proportion of greenhouse gases emissions [9], these feedstuffs provide a  valuable mean of animal by‐products utilization and upgrade the ecological efficiency of  the whole poultry production process [10]. Thus, the use of land animal proteins could  enhance aquaculture’s sustainability and eco‐efficiency, as these have a more favorable  carbon footprint and a higher environmental efficiency when compared with fishmeal and  plant alternatives [11,12].  Dietary protein manipulations, however, are known to affect the functionality of the  digestive system [13,14]. A functional digestive system is a prerequisite for the optimal  growth of fish with the liver being the main organ of nutrient deposition and metabolism  and the intestine being the primary site of nutrient digestion and absorption. Therefore,  studying any possible effects and alterations in the histomorphology of these tissues is  fundamental for the evaluation of the use of land animal proteins as fishmeal substitutes.  Most studies have focused on the effects of plant proteins as fish meal replacements [15]  with high substitution levels resulting in marked changes in hepatic and intestinal tissues,  such a reduced number of goblet cells, lipid accumulation in hepatocytes, shorter and  thinner mucosal folds and villi, steatosis, submucosal layer hypertrophy and impaired  structural integrity of the gut [13,15–17]. These alterations are mainly due to the presence  of various anti‐nutritional factors [18] which in turn cause pathophysiological changes in  the gastrointestinal tract and reduce nutrient digestibility.  On the other hand, very little is known about the effects of land animal proteins as  fishmeal  replacements  on the liver  and  intestinal  histology.  Findings  from  the  limited  studies that have been reported up to date have revealed that high inclusion levels of land  animal proteins may induce hepatic steatosis and increase hepatic lipid vacuolization in  Lateolabrax japonicus [19], in hybrid grouper [20,21] and in Lates calcarifer [22]. In addition,  negative  effects  on  the  intestinal  histology  have  also  been  reported  with  the  fishmeal  replacement by land animal proteins [22,23].  Gut microbes are essential for host nutrition and immunity [24] and changes in their  community composition are related to stress and dysbiosis. Fish gut microbes are linked  to the diet since different microbiota persist under different nutritional conditions along  with  the  different  enzymes  produced  (proteases,  lipases,  esterases,  cellulases)  that  contribute to better food digestion by the host [25,26]. It has been shown that the use of  alternative protein sources can alter the gut microbiome of the host having a beneficial  impact on growth and immunity by triggering lactic acid bacteria (LAB) and cytokines  respectively [27].  The present study addressed the effects of poultry by‐product meal and hydrolyzed  feather meal on liver and intestinal histomorphology and on the intestinal microbiota of  gilthead seabream (Sparus aurata).  2. Materials and Methods  All experimental procedures were conducted according to the guidelines of the EU  Directive 2010/63/EU regarding the protection of animals used for scientific purposes. The  experiments were performed at the registered experimental facility (EL‐43BIO/exp‐01) of  the Laboratory of Aquaculture, Department of  Ichthyology and Aquatic Environment,  University of Thessaly by FELASA accredited scientists (functions A–D).  2.1. Feeding Trials and Experimental Diets  Two feeding trials were conducted in which the growth data were not the object of  the present study and are described in detail elsewhere [7,8]. Briefly, gilthead sea bream  (S.  aurata)  juveniles  were  raised  in  glass  tanks  (125  L)  with  recirculating  seawater  of  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  3  of  15  standard water quality (21.0 ± 1.0 °C, pH at 8.0 ± 0.4, salinity at 33 ± 0.5 g/L, dissolved  oxygen at >6.5 mg/L, total ammonia nitrogen at <0.1 mg/L). In feeding trial I, juveniles  with an initial mean weight of 2.5 ± 0.2 g were raised in quadruplicate groups (25 fish/tank,  4  tanks/dietary  group).  For  100  days  they  were  fed  to  satiation  with  one  of  the  five  isonitrogenous (50%) and isoenergetic (21 KJ/Kg) experimental diets [7,8], where the FM  protein  of  the  control  diet  (FM  diet)  was  replaced  by  either  poultry  by‐product  meal  (PBM) at 50% (PBM50 diet) and 100% (PBM100 diet) or by hydrolyzed feather meal (HFM)  at 50% (HFM50 diet) and 100% (HFM100 diet). In feeding trial II, juveniles with an initial  mean weight of 2.9 ± 0.3 g were raised in triplicate groups (25 fish/tank, 3 tanks/dietary  group). For 110 days they were fed to satiation with one of the seven isonitrogenous (50%)  and isoenergetic (21 KJ/Kg) experimental diets [7,8]. These diets used the same FM control  diet as before, but the FM protein was now replaced by PBM and HFM at lower levels:  25% without amino acid supplementation (PBM25 and HFM25 diets), 25% supplemented  with lysine and methionine ((PBM25+ and HFM25+ diets), and 50% supplemented with  lysine and methionine (PBM50+ and HFM50+ diets). At the end of each feeding trial, fish  were weighed individually and euthanized with an overdose of tricaine methanesulfonate  (MS 222, 300+ mg/L) according to the Directive 2010/63/EU and FELASA guidelines.  2.2. Histological Analysis and Measurements  For  the  feeding  trial  I,  two  fish  per  tank  were  randomly  sampled  (eight  fish  per  dietary  group).  The  liver  of  each  fish  was  removed  quickly  and  weighed  for  the  determination of hepatosomatic index. Liver and midgut samples were collected from  each fish, fixated into 10% formalin in filtered seawater for 24 h at 4 °C and then were  immediately dehydrated in graded series of ethanol, immersed in xylol, and embedded  in paraffin wax. Intestinal samples from the HFM100 group were not taken because the  fish  intestine  was  too  thin.  A  part  of  the  liver  of  fish  was  also  collected  for  the  determination of its fat content by exhaustive Soxhlet extraction using petroleum ether on  a  Soxtherm  Multistat/SX  PC  (Sox‐416  Macro,  Gerhard,  Germany).  Liver  and  intestine  sections of 4–7 μm were taken and stained with hematoxylin and eosin. All sections were  examined  under  a  microscope  (Bresser  Science  TRM  301,  Bresser  GmbH,  Rhede,  Germany) and any histological abnormalities were recorded. A digital camera (Bresser  MikroCam 5.0 MP, Bresser GmbH, Rhede, Germany) adjusted to the microscope was used  for  acquiring  histological  section  images.  For  feeding  trial  II,  2  fish  per  tank  were  randomly sampled (six fish per dietary group). The same procedures as in the feeding  trial I were followed for histological examination.  A  semi‐quantitative  grading  system  was  used  in  order  to  quantify  the  histopathological  alterations  of  the  examined  tissues  [28].  Severity  grading  used  the  following system: Grade 0 (not remarkable), Grade 1 (minimal), Grade 2 (mild), Grade 3  (moderate), Grade 4 (severe).  2.3. Microbiota Analysis‐DNA Extraction, Bioinformatics and Data Analysis  In  the  present  study,  the  effect  of  PBM  and  HFM  on  the  intestinal  microbiota  of  juvenile  S.  aurata  was  investigated  at  the  50%  FM  replacement  level  that  negatively  affected the fish growth performance see [7,8]. Thus, for the microbiota analysis fish from  PBM50 and HFM50 groups of the feeding trial I were used. Two fish per tank (eight fish  per  dietary  group)  were  randomly  sampled  and  dissected  using  sterile  lancets  and  forceps. The midgut was transferred in sterile particle‐free (<0.2 mL) sea water (SPFSW).  The gut’s contents were extruded by mechanical force with forceps, as we targeted the  resident gut microorganisms and not the ones associated with the ingested food. DNA  extraction and 454 tag‐pyrosequencing were performed as shown at Nikouli et al. [29].  Processing  of  the  resulting  sequences,  i.e.,  trimming  and  quality  control,  was  performed with the MOTHUR software (v 1.35.0 open access, University of Michigan, MI,  USA) [30]. Only sequences with ≥250 bp and no ambiguous or no homopolymers ≥8 bp  were considered for further analysis. These sequences were aligned and classified using  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  4  of  15  the SILVA SSU database (release 119) [31]. All sequences were binned into Operational  Taxonomic  Units  (OTUs)  and  were  clustered  (average  neighbor  algorithm)  at  97%  sequence similarity. Coverage values were calculated with MOTHUR (v 1.35.0). The batch  of  sequences  from  this  study  has  been  submitted  in  NCBI  Short  Read  Archive  under  accession  number  SRS1839183.  The  heatmaps  of the  dominant  OTUs  and  orders  were  implemented by the pheatmap function in the pheatmap package in R version 3.0.2). For  the  prediction  of  abundant  metabolic  pathways  the  Piphillin  algorithm  [http://secondgenome.com/Piphillin (accessed on 1 October 2020)] was used with support  of KEGG database [32].  2.4. Statistical Analysis  For  the  microbiota  analysis,  canonical  correspondence  analysis  (CCA)  was  performed using the R package vegan [33]. Similarly, the significance of morphological  parameters and diversity indices for the ordination of the samples was calculated using  the  function  envfit  of  the  same  package.  Differentially  abundant  categories  (taxa  or  subsystems)  between  samples  were  identified  with  DESeq  package  version  1.14.0  [34]  using the binomial test and false discovery rate (p < 0.05). For liver fat data, percentages  were subjected to one‐way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s post‐hoc  test to rank the groups using SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).  3. Results  3.1. Liver Histology  In fish fed the control FM diets only minimal alterations (grade 1) were detected in  their  hepatic  tissues  (Table  1,  Figures  1A  and  2A).  In  general,  the  liver  had  normal  structure with central hepatocytes’ nuclei and a small amount of lipid droplets in their  hepatocytes cytoplasm. In some of the hepatocytes the nuclei were not central but pressed  against the periphery of the cells. In the cytoplasm of the exocrine pancreas’ pyramidal  cells many large eosinophilic zymogen granules were observed. Fish fed the diets with  low  inclusion  levels  of  PBM  (PBM25  and  PBM25+  diets)  showed  a  similar  histomorphology to that of the control FM group (Figure 1B,C) and only two fish of the  PBM25+ group showed large lipid droplets around pancreatic islets (Figure 1D). Fish fed  the diets with a higher inclusion level of PBM, had mild (PBM50 fish, grade 2, Figure 1E)  to  moderate  (PBM100  fish,  grade  3,  Figure  1F)  alterations.  The  latter  group  had  also  increased signs of degeneration (Figure 1F). In some of the hepatocytes, the nuclei were  not  central  but  pressed  against  the  periphery  of  the  cells  (Figure  1E).  Within  the  hepatocytes,  medium  size  lipid  droplets  were  observed,  but  no  steatosis  or  liver  hemorrhage signs were detected to any fish. The liver histomorphology of fish fed the  PBM50+ diet that was supplemented with lysine and methionine was slightly better than  that of PBM50 fish.  Table 1. Severity score (0–4) for the observed histopathological alterations and liver fat (% of dry weight) in S. aurata fed  the experimental diets.    FM  PBM25  PBM25+  PΒM50  PBM50+  PBM100  HFM25  HFM25+  HFM50  HFM50+  HFM100  Severity score  Liver  1  1  1  2  2  3  1  1  3  2  4  Intestine  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  Liver fat (%)  38.0  36.2  40.6  42.0  43.2  42.5  35.7  36.9  42.7  40.8  7.8  As far as the effect of dietary hydrolyzed feather meal is concerned, fish fed with high  inclusion  levels  of  HFM  showed  moderate  (grade  3,  HFM50  fish)  to  severe  (grade  4,  HFM100 fish) alterations in their liver tissue (Figure 2C,D). These fish showed enlarged  lipid  droplets,  signs  of  pancreatic  islets  necrosis  and  hemorrhage,  which  were  more  intense  in  the  HFM100  fish.  Moreover,  the  latter  fish  showed  signs  of  liver  cirrhosis  (Figure 2D) with the regenerative nodules of hepatocytes to be surrounded by fibrous  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  5  of  15  connective  tissue.  The  supplementation  of  lysine  and  methionine  at  the  HFM50+  diet  resulted in less hepatic alterations (grade 2) and a normal hepatic structure compared to  the HFM50 fish, but still large lipid droplets and more hepatocytes with no central nuclei  were detected in these fish (Figure 2F). However, the replacement of fishmeal by HFM at  lower  levels  (HFM25,  HFM25+)  resulted  in  a  normal  liver  histomorphology  that  was  similar to that of the control FM group (Figure 2B,E).  Figure 1. Liver histopathological examination of S. aurata fed on PBM diets. (A) fish fed FM diet— normal liver structure; (B) fish fed PBM25 diet—normal liver structure; (C) fish fed PBM25+ diet— normal liver structure; (D) fish fed PBM25+ diet—large lipid droplets (*) around pancreatic islets in  some fish; (E) fish fed PBM50 diet—medium size lipid droplets with some nuclei pressed against  the periphery of the cells; (F) fish fed PBM100 diet—liver degeneration.  Figure 2. Liver histopathological examination of S. aurata fed on HFM diets. (A) fish fed FM diet— normal liver structure; (B) fish fed HFM25 diet—normal liver structure; (C) fish fed HFM100 diet— hemorrhage signs (*) and large lipid droplets (arrows); (D) fish fed HFM100 diet—signs of liver  cirrhosis; (E) fish fed HFM25+ diet—normal liver structure; (F) fish fed HFM50+ diet—hepatocytes  with no central nuclei were detected.  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  6  of  15  3.2. Intestinal Histology  All the experimental groups of fish of both feeding trials revealed a normal intestinal  histology  and  none  of  them  showed  any  signs  of  inflammation  (Figures  3  and  4).  Enterocytes were distinct, while goblet cells and apical epithelial vacuoles were normally  present  (Figure  3A).  In  addition,  abundant  eosinophils  cells  were  normally  observed  within the submucosa layer of all fish (Figure 3B).  Figure 3. Midgut histopathological examination of S. aurata fed on PBM diets. (A) fish fed FM diet— normal gut structure with goblet cells (*) present; (B) fish fed PBM50 diet—eosinophil cells (arrow)  accumulation  within  the  muscularis  layer.  Abundant  eosinophils  cells  were  normally  observed  within the submucosa layer (arrowhead); (C) fish fed PBM25 diet—normal structure; (D) fish fed  PBM100 diet—normal structure with goblet cells (*) present.  Figure 4. Midgut histopathological examination of S. aurata fed on HFM diets. (A) fish fed FM diet;  (B) fish fed HFM50 diet; (C) fish fed HFM25 diet; (D) fish fed HFM50+ diet. In all images, the gut  structure appeared normal with goblet cells (*) present.  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  7  of  15  3.3. Intestinal Microbiota  The gut bacterial diversity of fish was studied using 454‐pyrosequencing. From the  24  samples  analyzed  in  total  only  eight  provided  a  satisfactory  number  of  sequences  (>100) combined with coverage >90% (Table 2). Taxonomic and potential species habitat  origin  was  further  studied,  as  well  as  similarities  between  the  bacterial  community  composition (BCC) of the different dietary groups. A total of 125 Operational Taxonomic  Units (Figure 5A) were identified from all 454 datasets, containing 5876 rRNA sequences  in  total  (Table  2).  Coverage  was  above  95%  for  all  samples,  while  diversity  was  low  (Shannon <3) in all samples with the lowest values (<2) being observed in the FM‐fed fish  (Table 2).  Table 2. Sequencing results, diversity indices and coverage values of fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets.  FMa  FMb  HFMa  HFMb  HFMc  HFMd  PBMa  PBMb  Richness  14  14  48  29  14  28  15  16  Sequences  2283  132  2206  325  196  181  234  319  Shannon  1.32  1.71  2.27  2.97  2.05  2.87  2.10  2.23  Cumulative abundance >1%  99.21  96.21  92.84  97.54  97.45  97.24  98.72  98.12  Coverage  1.00  0.95  0.99  0.99  0.97  0.97  0.99  0.99      (A)  (B)  Figure 5. (A) Venn diagram showing shared and unique OTUs between the dietary groups (FM,  PBM50 and HFM50); (B) Morisita similarities between fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets.  Morisita  similarities  between  samples  were  very  low  (<50%)  showing  no  specific  pattern according to the different diet fed (Figure 5B). Canonical correspondence analysis  also exhibited no pattern among fish of either the same or of a different dietary group but  revealed the importance of body weight for the ordination of the samples (p < 0.05) (Figure  6). At the phylum level, all samples were characterized by Proteobacteria and Actinobacteria,  which were the most abundant in almost all fish, as well as by Bacteroidetes and Firmicutes  (Figure  7A).  At  the  OTU  level,  a  total  number  of  64  OTUs  were  detected  in  relative  abundances >1% in at least one fish. Overall, these OTUs accounted for more than 97% of  the total diversity in all samples (Table 2). Similarly, OTUs with relative abundance >10%  clearly representing persistent members of BCC reached cumulative abundances >50% in  all  samples  (Figure  7B)  and  represented  different  species  of  Alpha‐,  Beta‐,  Gamma‐ proteobacteria, Actinobacteria, Flavobacteria, Bacilli and Clostridia (Figure 7B). In total, 6 OTUs  were  shared  amongst  all  dietary  groups  (Figure  5)  and  belonged  to  the  genera  Staphylococcus, Pseudomonas, Delftia, Cutibacterium and Hydrogenophaga (Figure 7B). Most  of them (5) belonged to the abundant species that dominated (>10%) at least in one sample  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  8  of  15  (Figure 7B). The cumulative abundances of this ‘core’ microbiome that was identified from  habitat ranged from 6.1% (HFMa) to 99.2% (FMa) (Figure 7B). The lowest values for core  microbiome  relative  abundances  were  observed  in  the  HFM  fish  with  an  average  of  20.15% contrary to 63.34% and 43.81% in the FM and PBM fish, respectively. This was  attributed to the unique abundant species that were detected in the HFM fish, belonging  to  different  Actinobacteria,  such  as  Propiomicromonospora  and  to  other  species,  such  as  Roseomonas and Sphingomonas.  Figure 6. Canonical correspondence analysis for fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets. Only  factors with significant values (p < 0.05) are presented.  (A)  (B)  Figure 7. (A) Relative abundances of different bacterial phyla in fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets; (B) Relative  abundances of abundant (>10%; left axis) and shared (between treatments) OTUs (right y‐axis) in fish fed the FM, PBM50  and HFM50 diets.  Differences in predicted functional pathways based on the bacterial abundance did  not  exhibit  any  significant  grouping  of  the  samples  based  on  the  different  diet  fed.  However, some pathways were found to be significantly different (p < 0.05) among the  different  dietary  groups  (Figure  8).  Overall,  pathways  for  renin‐angiotensin  system,  retinol metabolism and cAMP signaling were decreased in fish fed the FM diet compared  to those fed either the HFM or the PBM diet. This suggests gut dysbiosis in the two latter  groups  and  possibly  an  effort  to  use  alternative  carbon  sources.  Steroid  degradation  pathways showed a statistically significant increase in the HFM fed fish, indicating that  microbial communities were using alternative carbon sources.  PBM HFM FM Appl. Sci. 2021, 11, 8806  9  of  15  Renin-angiotensin_system_[PATH:ko04614] cAMP_signaling_pathway_[PATH:ko04024] Retinol_metabolism_[PATH:ko00830] Sesquiterpenoid_and_triterpenoid_biosynthesis_[PATH:ko00909] Lipopolysaccharide_biosynthesis_[PATH:ko00540] Betalain_biosynthesis_[PATH:ko00965] Biofilm_formation_-_Pseudomonas_aeruginosa_[PATH:ko02025] Steroid_degradation_[PATH:ko00984] Figure 8. Significantly different (p < 0.05) predicted functional pathways of the bacterial relative  abundances between fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets.  4. Discussion  Non‐ruminant processed animal proteins, such as hydrolyzed feather meal (HFM)  and  poultry  by‐product  meal  (PBM)  have  been  used  successfully  to  replace  fishmeal  protein in the diets of several farmed fish and crustacean species [5–8,35–39]. However,  knowledge of their effects on the histology of digestive organs, the intestinal microbiota  and digestive physiology is extremely limited. Histology is a valuable tool that is used to  describe tissue alterations and to detect any possible pathological signs in fish that may  be caused by dietary protein modifications. In addition, intestinal microbiota profiling  may assess fish intestinal function, health and nutrition [40,41].  4.1. Liver Histology  In the present study, the inclusion of poultry by‐product meal or hydrolyzed feather  meal caused no to severe alterations in the hepatic tissue of S. aurata and these alterations  were  dependent  on  the level  of fishmeal  protein  replacement.  Neither  PBM  nor  HFM  altered  the  liver  histomorphology  of  seabream  when  these  animal  proteins  replaced  fishmeal at 25%. However, at higher replacement levels more lipid droplets and increased  hepatic vacuolization were observed, and these changes were more pronounced in fish  fed HFM diets. In general, high inclusion levels of PBM caused mild to moderate hepatic  alterations compared to the high inclusion levels of HFM that caused severe alterations,  particularly in the case of total fishmeal replacement. Although there were no signs of  steatosis,  which  may  be  caused  by  the  increased  lipid  vacuolization,  the  total  FM  replacement by HFM, contrary to PBM, led to haemorrhage, pancreatic islet necrosis and  cirrhosis in a substantial number of fish that were examined. The dietary supplementation  of PBM and HFM with essential amino acids, such as lysine and methionine, seemed to  improve the digestive physiology. Fish fed these diets showed fewer hepatic alterations  and abnormalities compared to fish fed diets of a similar replacement level but without  amino acid supplementation.  The present findings contradict with those reported by Sabbagh et al. [42] in which  the  100%  replacement  of  FM  by  PBM  did  not  cause  any  liver  alteration  in  S.  aurata.  Although in both studies the total FM replacement by PBM did not lead to any clear signs  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  10  of  15  of  steatosis,  the  mild  increase  in  lipid  vacuolization  with  the  increase  of  PBM  dietary  inclusion observed in the current study may indicate a lower lipid digestibility of the PBM  fat. This indication is supported by the fact that fish fed diets with high inclusion levels of  PBM had increased fat in their livers (Table 1), although this cannot be clearly said for the  HFM fed fish. It has been suggested that that a hepatic lipid accumulation may occur  because the excessive dietary intake of lipids that surpasses the physiological capability  of  the  liver  to β‐oxidize  them,  thus  leading  to  larger  lipid  droplets  and  subsequent  steatosis [43]. However, in our study the dietary lipid intake of PBM and HFM fed fish  was lower than that of FM fed fish see [7,8], which indicates that dietary lipids, specifically  of PBM and HFM lipids, inducehepatic lipid accumulation in S. aurata.  Increased lipid droplets and hepatic vacuolization with signs of inflammation have  also been reported in Lates calcarifer [22,44] and in Tinca tinca [45] when the FM in the fish  fed diets were completely replaced  with PBM. Moreover, Zhou  et al. [21]  reported an  induced steatosis in the hepatocytes of hybrid grouper even when fish were fed diets with  50–70% FM replacement levels by PBM. On the other hand, the total replacement of FM  by PBM did not cause any increased vacuolization or alterations in the hepatocytes of  Salmo salar [14] and of Oreochromis niloticus [46]. The effects of dietary HFM as a sole FM  replacement on fish  liver histomorphology are not well studied. Hartviksen et al. [14]  stated that a diet with total FM replacement by HFM did not reveal signs of steatosis in  Salmo salar with hepatocytes having even a lower fat accumulation than to those fed on  FM. Studies using HFM in a blend with other animal proteins, including PBM, for FM  replacement  have  reported  that  high  substitution  levels  induce  hepatic  lipidosis  and  steatosis in Lateolabrax japonicus [19] and in hybrid grouper [20].  4.2. Intestinal Histology  The inclusion of poultry by‐product meal or hydrolyzed feather meal did not cause  any intestinal histological alterations in seabream compared to fish fed the FM‐based diet.  All fish showed distinct enterocytes with abundant eosinophils cells, with goblet cells and  apical epithelial vacuoles being present along the entire intestine of fish. Goblet cells assist  fish health and nutrition as the mucus secreted by them acts as a protection medium to  the epithelium, while also lubricates undigested materials for onward progression into  the  rectum  [47,48].  Moreover,  apical  epithelial  vacuoles  consist  integral  structural  components of the intestine that are responsible for nutrient absorption [49]. Although the  present findings do not provide a sufficient evidence for the absorption of PBM and HFM,  it can be claimed that these land animal proteins did not result in signs of malnutrition or  inflammation, such as enteritis. This applies for all tested FM replacement levels, except  for total replacement by HFM which was not feasible to examine. Similarly, an unaffected  intestinal histology was reported in Atlantic salmon fed on high levels of PBM [50] and in  Nile tilapia fed on high levels of HFM [51] replacing dietary FM. Hartviksen et al. [14]  working  with  Atlantic  salmon  reported  no  severe  signs  of  enteritis  and  unaffected  numbers  of  eosinophilic  granular  cells  in  fish  fed  either  with  PBM  or  HFM  replacing  dietary fishmeal at a level close to 50%. However, the authors reported that PBM led to a  decreased submucosa width, while HFM led to a decreased presence of goblet cells and  an increased presence of apical epithelial vacuoles in the intestine. Moreover, Chaklader  et al. [22] reported a dysregulated intestinal morphology with smaller microvilli of shorter  diameter  in  juvenile  barramundi  fed  on  PBM  totally  replacing  dietary  fishmeal.  Furthermore,  Yu  et  al.  [23]  working  with  Pengze  crucian  carp  reported  shortened  microvillus and enterocytes and thinner muscular thickness when HFM replaced more  than 30% of dietary fishmeal protein.  4.3. Intestinal Microbiota  Regarding the dietary effects on the intestinal microbiota, it can be argued that no  clear effects were detected from the use of HFM or PBM. The gut Bacterial Community  Composition (BCC) of S. aurata fed either FM, PBM or HFM was characterized by groups  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  11  of  15  that  are  commonly  found  in  the  fish  gut  microbiome.  The  core  genera  Pseudomonas,  Cutibacterium,  Staphylococcus  and  Delftia  have  been  previously  reported  as  core  microbiome  of  S.  aurata  farmed  in  several  geographical  sites  [29,52],  suggesting  that  certain bacterial genera are capable of colonizing the seabream gut independently of the  diet and location. Similar findings have been reported for Salmo salar [41] with authors  stating  that  the  role  of  fish‐hosts  in  selecting  or  promoting  core  microbes  is  unclear.  Actinobacteria species were dominant and unique in the HFM fed fish and their dominance  could  be  related  to  their  antimicrobial  functions  (i.e.,  antibiotics)  that  protect  the  host  [53,54]. Additionally, the prevalence of terpenoid biosynthesis genes that were prevalent  in the HFM fed fish is mostly detected in Actinobacteria [55] and was in accordance with  the taxonomic BCC (Figure 7A,B). The Sphingomonas species in the gut have been found  to be negatively correlated with weight gain [56] which also agrees with our CCA data  (Figure 6).  The predicted pathways that were enriched in the HFM and PBM fed fish compared  to FM fed fish were mostly related to functions that imply gut dysbiosis. For instance,  increased  renin‐angiotensin  system  (RAS)  genes  have  been  related  to  RAS  system  activation which implies malnutrition [57,58]. Gut dysbiosis that promotes RAS activation  is mostly related to decreased abundances of fermenting bacteria, which was the case in  the HFM and PBM groups of fish. Similarly, bacterial retinol metabolism predicted genes  indicate  a  potential  need  for  vitamin  A  production  that  enhances  mucosal  immunity.  Thus, bacteria able to participate in retinol metabolism also assist in avoiding pathogen  invasion [59].  Knowledge of the effects of fishmeal replacement  by land animal proteins on the  intestinal microbiota is extremely limited. In the present study, as stated above, there was  no specific  pattern in  the bacterial  communities among fish fed  either fishmeal or the  tested  land  animal  proteins.  Gajardo  et  al.  [41],  working  with  Salmo  salar,  reported  a  significant effect of the dietary PBM on the distal intestine digesta and mucosa. This study  found significantly higher and lower abundances of specific genera in fish fed PBM than  in  fish  fed  on  a  FM‐based  diet.  Hartviksen  et  al.  [14],  also  working  with  Salmo  salar,  reported  that  the  use  of  HFM  and  PBM  as  fishmeal  replacements  increased  the  total  allochthonous  and  total  autochthonous  bacteria  in  the  distal  intestine,  but  the  total  autochthonous bacteria in the proximal intestine remained unaffected. The authors also  reported that the supplementation of HFM caused significant increases in specific genera  (Corynebacteriaceae, Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Pseudomonadaceae, Xanthomonadaceae)  and  decreases  in  another  (Vibrionaceae).  Furthermore,  PBM  caused  increases  in  Corynebacteriaceae  and  decreases  in  b‐Proteobacteria,  Bacilli‐like,  Peptostreptococcaceae  and  Vibrionaceae.  Certainly,  a  better  understanding  of  the  functional  roles  of  the  intestinal  microbiota communities of fish and to what extent these are affected by the use of land  animal proteins is needed.  5. Conclusions  In  conclusion,  fishmeal  replacement  by  either  poultry  by‐product  meal  or  hydrolyzed feather meal did not cause any intestinal histological alterations. Thus, these  results indicate normal digestion and absorption in the midgut of S. aurata even when  their dietary fishmeal protein is completely replaced. Neither land animal proteins altered  the  liver  histomorphology  of  gilthead  seabream  when  fishmeal  was  replaced  at  25%.  However, at higher replacement levels increased lipid droplets and hepatic vacuolization  were  observed  to  be  more  pronounced  in  fish  fed  HFM  diets.  Moreover,  the  dietary  supplementation  of  PBM  and  HFM  with  essential  lysine  and  methionine  seemed  to  improve the digestive physiology, as fish fed these diets showed fewer hepatic alterations  and abnormalities compared to diets of a similar replacement level but without amino  acid supplementation. The dominant phyla in the intestinal microbiota were Proteobacteria  (58.8%)  and  Actinobacteria  (32.4%),  but  no  specific  pattern  was  observed  among  the  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  12  of  15  different dietary fish groups at any taxonomic level. This finding was probably driven by  the high inter‐individual variability observed.  Author Contributions: Conceptualization, I.T.K., E.M. and K.A.K.; Methodology, P.P., A.M. and  P.B.; Software, P.P., A.M. and P.B.; Validation, I.T.K., E.M. and K.A.K.; Formal Analysis, P.P., A.M.  and P.B.; Investigation, P.P., A.M. and P.B.; Resources, I.T.K., E.M., P.B. and K.A.K.; Data Curation,  I.T.K., K.A.K. and E.M.; Writing—Original Draft Preparation, P.P. and A.M.; Writing—Review &  Editing,  I.T.K.,  P.B.,  K.A.K.,  E.M.;  Supervision,  I.T.K.,  E.M.  and  K.A.K.;  Project  Administration,  I.T.K.; Funding Acquisition, I.T.K. All authors have read and agreed to the published version of the  manuscript.  Funding: This research was funded by the Operational Programme “Fisheries 2007–2013” (Ministry  of  Rural  Development  and  Food  of  the  Hellenic  Republic/European  Fisheries  Fund)  under  the  project  title  “The  use  of  Processed  Animal  Proteins  in  the  feeds  of  gilt‐head  seabream  (Sparus  aurata)”, Grant Number: 2014ΣΕ086800090000.  Institutional Review Board Statement: The study was conducted according to the guidelines of EU  legal frameworks related to the welfare and protection of animals for scientific purposes (Directive  2010/63/EU) and in strict accordance with the University of Thessaly’s Ethics Committee on the Use  of Animals in Research (protocol approval 20 December 2016).  Informed Consent Statement: Not applicable  Data Availability Statement: The data presented in this study are available on request from the  corresponding author  Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.  References  1. FAO. The State of World Fishery and Aquaculture 2020 (SOFIA); Food and Agriculture Organization of the United Nations: Rome,  Italy, 2020; doi:10.4060/ca9229en.  2. Cultured  Aquatic  Species  Information  Programme.  Sparus  aurata  (Linnaeus,  1758).  FAO.  Available  online:  http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Sparus_aurata/en (accessed on 24 July 2021).  3. Jannathulla, R.; Rajaram, V.; Kalanjiam, R.; Ambasankar, K.; Muralidhar, M.; Dayal, J.S. Fishmeal availability in the scenarios  of climate change: Inevitability of fishmeal replacement in aquafeeds and approaches for the utilization of plant protein sources.  Aquac. Res. 2019, 50, 3493–3506.  4. Yu,  H.‐R.;  Zhang,  Q.;  Cao,  H.;  Wang,  X.‐Z.;  Huang,  G.‐Q.;  Zhang,  B.‐R.;  Fan,  J.‐J.;  Liu,  S.‐W.;  Li,  W.‐Z.;  Cui,  Y.  Apparent  digestibility coefficients of selected feed ingredients for juvenile snakehead, Ophiocephalus argus. Aquac. Nutr. 2012, 19, 139–147,  doi:10.1111/j.1365‐2095.2012.00947.x.  5. González‐Rodríguez, Á.; Celada, J.D.; Carral, J.M.; Sáez‐Royuela, M.; García, V.; Fuertes, J.B. Evaluation of poultry by‐product  meal as partial replacement of fish meal in practical diets for juvenile tench (Tinca tinca L.). Aquac. Res. 2014, 47, 1612–1621,  doi:10.1111/are.12622.  6. Campos,  I.;  Matos,  E.;  Marques,  A.;  Valente,  L.M.  Hydrolyzed  feather  meal  as  a  partial  fishmeal  replacement  in  diets  for  European seabass (Dicentrarchus labrax) juveniles. Aquaculture 2017, 476, 152–159, doi:10.1016/j.aquaculture.2017.04.024.  7. Karapanagiotidis, I.T.; Psofakis, P.; Mente, E.; Malandrakis, E.; Golomazou, E. Effect of fishmeal replacement by poultry by‐ product meal on growth performance, proximate composition, digestive enzyme activity, haematological parameters and gene  expression of gilthead seabream (Sparus aurata). Aquac. Nutr. 2019, 25, 3–14, doi:10.1111/anu.12824.  8. Psofakis, P.; Karapanagiotidis, I.; Malandrakis, E.; Golomazou, E.; Exadactylos, A.; Mente, E. Effect of fishmeal replacement by  hydrolyzed  feather  meal  on  growth  performance,  proximate  composition,  digestive  enzyme  activity,  haematological  parameters  and  growth‐related  gene  expression  of  gilthead  seabream  (Sparus  aurata).  Aquaculture  2020,  521,  735006,  doi:10.1016/j.aquaculture.2020.735006.  9. Enzing, C.; Ploeg, M.; Barbosa, M.; Sijtsma, L. Microalgae‐Based Products for the Food and Feed Sector: An Outlook for Europe; Report  EUR 26255; Publications Office of the European Union: Luxembourg, 2014.  10. Maiolo, S.; Parisi, G.; Biondi, N.; Lunelli, F.; Tibaldi, E.; Pastres, R. Fishmeal partial substitution within aquafeed formulations:  Life cycle assessment of four alternative protein sources. Int. J. Life Cycle Assess. 2020, 25, 1455–1471, doi:10.1007/s11367‐020‐ 01759‐z.  11. den Hartog, L.A.; Sijtsma, S.R. Sustainable feed ingredients. In Proceedings of the 12th International Symposium of Australian  Renderers Association “Rendering for Sustainability”, Victoria, Australia, 23–26 July 2013; pp. 18–26.  12. Maiolo,  S.;  Cristiano,  S.;  Gonella,  F.;  Pastres,  R.  Ecological  sustainability  of  aquafeed:  An  emergy  assessment  of  novel  or  underexploited ingredients. J. Clean. Prod. 2021, 294, 126266, doi:10.1016/j.jclepro.2021.126266.  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  13  of  15  13. Martínez‐Llorens, S.; Baeza‐Ariño, R.; Nogales‐Mérida, S.; Jover‐Cerdá, M.; Tomás‐Vidal, A. Carob seed germ meal as a partial  substitute in gilthead sea bream (Sparus aurata) diets: Amino acid retention, digestibility, gut and liver histology. Aquaculture  2012, 338‐341, 124–133, doi:10.1016/j.aquaculture.2012.01.029.  14. Hartviksen, M.A.B.; Vecino, J.L.G.; Ringo, E.; Bakke, A.M.; Wadsworth, S.; Krogdahl, A.; Ruohonen, K.; Kettunen, A. Alternative  dietary protein sources for Atlantic salmon (Salmo salar L.) effect on intestinal microbiota, intestinal and liver histology and  growth. Aquac. Nutr. 2014, 20, 381–398, doi:10.1111/anu.12087.  15. Baeza‐Ariño, R.; Martínez‐Llorens, S.; Nogales‐Mérida, S.; Jover‐Cerdá, M.; Tomás‐Vidal, A. Study of liver and gut alterations  in  sea  bream,  Sparus  aurata  L.,  fed  a  mixture  of  vegetable  protein  concentrates.  Aquac.  Res.  2014,  47,  460–471,  doi:10.1111/are.12507.  meal replacement by plant  16. Sitjà‐Bobadilla, A.; Peña‐Llopis, S.; Requeni, P.G.; Médale, F.; Kaushik, S.; Sánchez, J.P. Effect of fish  protein sources on non‐specific defence mechanisms and oxidative stress in gilthead sea bream (Sparus aurata). Aquaculture 2005,  249, 387–400, doi:10.1016/j.aquaculture.2005.03.031.  17. Kokou, F.; Sarropoulou, E.; Cotou, E.; Rigos, G.; Henry, M.; Alexis, M.; Kentouri, M. Effects of Fish Meal Replacement by a  Soybean Protein on Growth, Histology, Selected Immune and Oxidative Status Markers of Gilthead Sea Bream, Sparus aurata.  J. World Aquac. Soc. 2015, 46, 115–128, doi:10.1111/jwas.12181.  18. Krogdahl, Å.; Penn, M.; Thorsen, J.; Refstie, S.; Bakke, A.M. Important antinutrients in plant feedstuffs for aquaculture: An up‐ date on recent findings regarding responses in salmonids. Aquac. Res. 2010, 41, 333–344.  19. Hu, L.; Yun, B.; Xue, M.; Wang, J.; Wu, X.; Zheng, Y.; Han, F. Effects of fish meal quality and fish meal substitution by animal  protein blend on growth performance, flesh quality and liver histology of Japanese seabass (Lateolabrax japonicus). Aquaculture  2013, 372‐375, 52–61, doi:10.1016/j.aquaculture.2012.10.025.  20. Ye, H.; Zhou, Y.; Su, N.; Wang, A.; Tan, X.; Sun, Z.; Zou, C.; Liu, Q.; Ye, C. Effects of replacing fish meal with rendered animal  protein blend on growth performance, hepatic steatosis and immune status in hybrid grouper (Epinephelus fuscoguttatus♀ ×  Epinephelus lanceolatus♂). Aquaculture 2019, 511, 734203, doi:10.1016/j.aquaculture.2019.734203.  21. Zhou, Z.; Yao, W.; Ye, B.; Wu, X.; Li, X.; Dong, Y. Effects of replacing fishmeal protein with poultry by‐product meal protein  and  soybean  meal  protein  on  growth,  feed  intake,  feed  utilization,  gut  and  liver  histology  of  hybrid  grouper  (Epinephelus  fuscoguttatus ♀ × Epinephelus lanceolatus ♂) juveniles. Aquaculture 2020, 516, 734503, doi:10.1016/j.aquaculture.2019.734503.  22. Chaklader, R.; Siddik, M.A.B.; Fotedar, R. Total replacement of fishmeal with poultry by‐product meal affected the growth,  muscle quality, histological structure, antioxidant capacity and immune response of juvenile barramundi, Lates calcarifer. PLoS  ONE 2020, 15, e0242079, doi:10.1371/journal.pone.0242079.  23. Yu, R.; Cao, H.; Huang, Y.; Peng, M.; Kajbaf, K.; Kumar, V.; Tao, Z.; Yang, G.; Wen, C. The effects of partial replacement of  fishmeal protein by hydrolysed feather meal protein in the diet with high inclusion of plant protein on growth performance,  fillet quality and physiological parameters of Pengze crucian carp (Carassius auratus var. Pengze). Aquac. Res. 2019, 51, 636–647,  doi:10.1111/are.14411.  24. Perry,  W.B.;  Lindsay,  E.;  Payne,  C.J.;  Brodie,  C.;  Kazlauskaite,  R.  The  role  of  the  gut  microbiome  in  sustainable  teleost  aquaculture. Proc. R. Soc. B 2020, 287, 20200184.  25. Ray,  A.; Ghosh,  K.; Ringø, E. Enzyme‐producing  bacteria isolated from  fish  gut: A  review.  Aquac.  Nutr.  2012,  18,  465–492,  doi:10.1111/j.1365‐2095.2012.00943.x.  26. Wu, S.; Ren, Y.; Peng, C.; Hao, Y.; Xiong, F.; Wang, G.; Li, W.; Zou, H.; Angert, E.R. Metatranscriptomic discovery of plant  biomass‐degrading  capacity  from  grass  carp  intestinal  microbiomes.  FEMS  Microbiol.  Ecol.  2015,  91,  fiv107,  doi:10.1093/femsec/fiv107.  27. Foysal, J.; Fotedar, R.; Tay, C.‐Y.; Gupta, S.K. Dietary supplementation of black soldier fly (Hermetica illucens) meal modulates  and  gut microbiota, innate immune response and health status of marron (Cherax cainii, Austin 2002) fed poultry‐by‐product  fishmeal based diets. PeerJ 2019, 7, e6891, doi:10.7717/peerj.6891.  28. Johnson, R.; Wolf, J.; Braunbeck, T. OECD Guidance Document for the Diagnosis of Endocrine‐Related Histopathology of Fish Gonads;  Organization  for  Economic  Co‐operation  and  Development  2009;  p.  96. Available  online:  https://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/42140701.pdf (accessed on 14 April 2020).  29. Nikouli,  E.;  Meziti,  A.;  Antonopoulou,  E.;  Mente,  E.;  Kormas,  K.A.  Gut  Bacterial  Communities  in  Geographically  Distant  Populations  of  Farmed  Sea  Bream  (Sparus  aurata)  and  Sea  Bass  (Dicentrarchus  labrax).  Microorganisms  2018,  6,  92,  doi:10.3390/microorganisms603009.  30. Schloss, P.D.; Westcott, S.L.; Ryabin, T.; Hall, J.R.; Hartmann, M.; Hollister, E.B.; Lesniewski, R.A.; Oakley, B.B.; Parks, D.H.;  Robinson, C.J.; et al. Introducing mothur: Open‐Source, Platform‐Independent, Community‐Supported Software for Describing  and Comparing Microbial Communities. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75, 7537–7541, doi:10.1128/aem.01541‐09.  31. Pruesse, E.; Quast, C.; Knittel, K.; Fuchs, B.M.; Ludwig, W.; Peplies, J.; Glöckner, F.O. SILVA: A comprehensive online resource  for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 2007, 35, 7188–7196,  doi:10.1093/nar/gkm864.  32. Iwai, S.; Weinmaier, T.; Schmidt, B.L.; Albertson, D.G.; Poloso, N.J.; Dabbagh, K.; DeSantis, T.Z. Piphillin: Improved Prediction  of  Metagenomic  Content  by  Direct  Inference  from  Human  Microbiomes.  PLoS  ONE  2016,  11,  e0166104,  doi:10.1371/journal.pone.0166104.     Appl. Sci. 2021, 11, 8806  14  of  15  33. Oksanen, J.; Blanchet,  F.G.; Friendly, M.;  Kindt,  R.; Legendre, P.; McGlinn,  D.; Minchin,  P.R.; O’Hara, R.B.; Simpson, G.L.;  Solymos, P.; Henry, M.; Stevens, H.; Szoecs, E.; Wagner, H. vegan: Community Ecology Package. Ordination methods, Diversity  Analysis  and  Other  Functions  for  Community  and  Vegetation  Ecologists.  2021.  Available  online:  http://outputs.worldagroforestry.org/cgi‐bin/koha/opac‐detail.pl?biblionumber=39504 (accessed on 27 July 2021).  34. Anders, S.; Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 2010, 11, R106.  35. Li, K.; Wang, Y.; Zheng, Z.X.; Jiang, R.L.; Xie, N.X. Replacing fishmeal with rendered animal protein ingredients in diets for  Malabar grouper, Epinephelus malabaricus, reared in net pens. J. World Aquac. Soc. 2009, 40, 67–75.  36. Hernãndez, C.; Olvera‐Novoa, M.; Hardy, R.; Hermosillo, A.; Reyes, C.; Gonzãlez, B. Complete replacement of fish meal by  porcine and poultry by‐product meals in practical diets for fingerling Nile tilapia Oreochromis niloticus: Digestibility and growth  Aquac. Nutr. 2010, 16, 44–53, doi:10.1111/j.1365‐2095.2008.00639.x.  performance.  37. Hernández, C.; Sanchez‐Gutierrez, Y.; Hardy, R.W.; Benitez‐Hernández, A.; Domínguez‐Jimenez, P.; González‐Rodríguez, B.;  Osuna‐Osuna, L.; Tortoledo, O. The potential of pet‐grade poultry by‐product meal to replace fish meal in the diet of the juvenile  spotted rose snapper Lutjanus guttatus (Steindachner, 1869). Aquac. Nutr. 2014, 20, 623–631, doi:10.1111/anu.12122.  38. Fuertes, J.; Celada, J.D.; Carral, J.M.; Sáez‐Royuela, M.; Gonzalez‐Rodriguez, A. Effects of fishmeal replacement by feather meal  in  practical  diets  for  juvenile  crayfish  (Pacifastacus  leniusculus  Dana,  Astacidae).  Aquac.  Nutr.  2013,  20,  36–43,  doi:10.1111/anu.12044.  39. Zapata, D.B.; Lazo, J.P.; Herzka, S.Z.; Viana, M.T. The effect of substituting fishmeal with poultry by‐product meal in diets for  Totoaba macdonaldi juveniles. Aquac. Res. 2016, 47, 1778–1789.  40. Ringø, E.; Zhou, Z.; Vecino, J.L.G.; Wadsworth, S.; Romero, J.; Krogdahl, Å.; Olsen, R.E.; Dimitroglou, A.; Foey, A.; Davies, S.;  et al. Effect of dietary components on the gut microbiota of aquatic animals. A never‐ending story? Aquac. Nutr. 2016, 22, 219– 282, doi:10.1111/anu.12346.  41. Gajardo, K.; Jaramillo‐Torres, A.; Kortner, T.M.; Merrifield, D.L.; Tinsley, J.; Bakke, A.M.; Krogdahl, Å. Alternative Protein  Sources in the Diet Modulate Microbiota and Functionality in the Distal Intestine of Atlantic Salmon (Salmo salar). Appl. Environ.  Microbiol. 2017, 83, 83, doi:10.1128/aem.02615‐16.  42. Sabbagh, M.; Schiavone, R.; Brizzi, G.; Sicuro, B.; Zilli, L.; Vilella, S. Poultry by‐product meal as an alternative to fish meal in the  juvenile gilthead seabream (Sparus aurata) diet. Aquaculture 2019, 511, 734220, doi:10.1016/j.aquaculture.2019.734220.  43. Spisni, E.; Tugnoli, M.; Ponticelli, A.; Mordenti, T.; Tomasi, V. Hepatic steatosis in artificially fed marine teleosts. J. Fish Dis.  1998, 21, 177–184.  44. Siddik, M.A.B.; Chungu, P.; Fotedar, R.; Howieson, J. Bioprocessed poultry by‐product meals on growth, gut health and fatty  acid synthesis of juvenile barramundi, Lates calcarifer (Bloch). PLoS ONE 2019, 14, e0215025, doi:10.1371/journal.pone.0215025.  45. Panicz, R.; Żochowska‐Kujawska, J.; Sadowski, J.; Sobczak, M. Effect of feeding various levels of poultry by‐product meal on  the  blood  parameters,  filet  composition  and  structure  of  female  tenches  (Tinca  tinca).  Aquac.  Res.  2017,  48,  5373–5384,  doi:10.1111/are.13351.  46. Aydín, B.; Gümüş, E.; Balci, B.A. Effect of dietary fish meal replacement by poultry by‐product meal on muscle fatty acid  composition and liver histology of fry of Nile tilapia, Oreochromis niloticus (Actinopterygii: Perciformes: Cichlidae). Acta Ichthyol.  et Piscat. 2015, 45, 343–351.  47. Deplancke, B.; Gaskins, H.R. Microbial modulation of innate defense: Goblet cells and the intestinal mucus layer. Am. J. Clin.  Nutr. 2001, 73, 1131S–1141S, doi:10.1093/ajcn/73.6.1131s.  48. Berillis, P.; Mente, E. Histology of Goblet Cells in the Intestine of the Rainbow Trout Can Lead to Improvement of the Feeding  Management. J. Fish. 2017, 11, 32–33, doi:10.21767/1307‐234x.1000139.  49. Ferguson, H.W. Systemic pathology of fish. In A Text and Atlas of Comparative Tissue Responses in Diseases of Teleosts, 2nd ed.;  Scotian Press: London, UK, 2006.  50. Hu, H.; Kortner, T.M.; Gajardo, K.; Chikwati, E.M.; Tinsley, J.; Krogdahl, Å. Intestinal Fluid Permeability in Atlantic Salmon  (Salmo salar L.) Is Affected by Dietary Protein Source. PLoS ONE 2016, 11, e0167515, doi:10.1371/journal.pone.0167515.  51. Tran‐Ngoc,  K.T.;  Haidar,  M.N.;  Roem,  A.J.;  Sendão,  J.;  Verreth,  J.;  Schrama,  J.W.  Effects  of  feed  ingredients  on  nutrient  digestibility, nitrogen/energy balance and morphology changes in the intestine of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquac. Res.  2019, 50, 2577–2590, doi:10.1111/are.14214.  52. Nikouli, E.; Meziti, A.; Smeti, E.; Antonopoulou, E.; Mente, E.; Kormas, K.A. Gut Microbiota of Five Sympatrically Farmed  Marine Fish Species in the Aegean Sea. Microb. Ecol. 2021, 81, 460–470, doi:10.1007/s00248‐020‐01580‐z.  53. El‐Rhman, A.M.A.; Khattab, Y.A.; Shalaby, A.M. Micrococcus luteus and Pseudomonas species as probiotics for promoting the  growth  performance  and  health  of  Nile  tilapia,  Oreochromis  niloticus.  Fish  Shellfish.  Immunol.  2009,  27,  175–180,  doi:10.1016/j.fsi.2009.03.020.  54. Akayli, T.; Albayrak, G.; Ürkü, Ç.; Çanak, Ö.; Yörük, E. Characterization of Micrococcus luteus and Bacillus marisflavi Recovered  from Common Dentex (Dentex dentex) Larviculture System. Mediterr. Mar. Sci. 2015, 17, 163, doi:10.12681/mms.1322.  55. Yamada,  Y.;  Kuzuyama,  T.;  Komatsu,  M.;  Shin‐Ya,  K.;  Omura,  S.;  Cane,  D.‐E.;  Ikeda,  H.  Terpene  synthases  are  widely  distributed in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 857–862, doi:10.1073/pnas.1422108112.  56. Dvergedal, H.; Sandve, S.R.; Angell, I.L.; Klemetsdal, G.; Rudi, K. Association of gut microbiota with metabolism in juvenile  Atlantic salmon. Microbiome 2020, 8, 1–8, doi:10.1186/s40168‐020‐00938‐2.  57. Perlot, T.; Penninger, J.M. ACE2—From the renin–angiotensin system to gut microbiota and malnutrition. Microbes Infect. 2013,  15, 866–873.  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  15  of  15  58. Lu, C.C.; Ma, K.L.; Ruan, X.Z.; Liu, B.C. Intestinal dysbiosis activates renal renin‐angiotensin system contributing to incipient  diabetic nephropathy. Int. J. Med. Sci. 2018, 15, 816–822, doi:10.7150/ijms.25543.  59. Iyer, N.; Vaishnava, S. Vitamin A at the interface of host‐commensal‐pathogen interactions. PLoS Pathog. 2019, 15, e1007750.  http://www.deepdyve.com/assets/images/DeepDyve-Logo-lg.png Applied Sciences Multidisciplinary Digital Publishing Institute

Effects of Dietary Fishmeal Replacement by Poultry By-Product Meal and Hydrolyzed Feather Meal on Liver and Intestinal Histomorphology and on Intestinal Microbiota of Gilthead Seabream (Sparus aurata)

Download PDF
15 pages

Loading next page...
 
/lp/multidisciplinary-digital-publishing-institute/effects-of-dietary-fishmeal-replacement-by-poultry-by-product-meal-and-rNcIO8giLg
Publisher
Multidisciplinary Digital Publishing Institute
Copyright
© 1996-2021 MDPI (Basel, Switzerland) unless otherwise stated Disclaimer The statements, opinions and data contained in the journals are solely those of the individual authors and contributors and not of the publisher and the editor(s). MDPI stays neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations. Terms and Conditions Privacy Policy
ISSN
2076-3417
DOI
10.3390/app11198806
Publisher site
See Article on Publisher Site

Abstract

Article  Effects of Dietary Fishmeal Replacement by Poultry by‐Product  Meal and Hydrolyzed Feather Meal on Liver and Intestinal   Histomorphology and on Intestinal Microbiota of Gilthead   Seabream (Sparus aurata)  1 1 1, 1,2 1 Pier Psofakis  , Alexandra Meziti  , Panagiotis Berillis  *, Eleni Mente  , Konstantinos A. Kormas     1, and Ioannis T. Karapanagiotidis *    Department of Ichthyology and Aquatic Environment, School of Agricultural Sciences, University of  Thessaly, Fytoko Street, 38446 Volos, Greece; psofakis@uth.gr (P.P.); ameziti@gmail.com (A.M.);  emente@uth.gr (E.M.); kkormas@uth.gr (K.A.K.)    Laboratory of Ichthyology–Culture and Pathology of Aquatic Animals, School of Veterinary Medicine,  Aristotle University of Thessaloniki, University Campus, 54006 Thessaloniki, Greece  *  Correspondence: pveril@uth.gr (P.B.); ikarapan@uth.gr (I.T.K.)  Featured Application: Poultry  by‐product meal  and hydrolyzed feather  meal can successfully  replace fishmeal at low dietary levels in feeds for farmed gilthead seabream and thus enhance  the environmental and economic sustainability of its production.  Citation: Psofakis, P.; Meziti, A.;  Abstract:  The  effects  on  liver  and  intestinal  histomorphology  and  on  intestinal  microbiota  in  Berillis, P.; Mente, E.; Kormas, K.A.;  gilthead  seabream  (Sparus  aurata)  fed  diets  that  contained  poultry  by‐product  meal  (PBM)  and  Karapanagiotidis, I.T. Effects of Dietary  hydrolyzed  feather  meal  (HFM)  as  fishmeal  replacements  were  studied.  Fish  fed  on  a  series  of  Fishmeal Replacement by Poultry by‐ isonitrogenous  and  isoenergetic  diets,  where  fishmeal  protein  of the  control  diet  (FM  diet)  was  Product Meal and Hydrolyzed Feather  Meal on Liver and Intestinal  replaced by either PBM or by HFM at 25%, 50% and 100% without amino acid supplementation  Histomorphology and on Intestinal  (PBM25, PBM50, PBM100, HFM25, HFM50 and HFM100 diets) or supplemented with lysine and  Microbiota of Gilthead Seabream  methionine (PBM25+, PBM50+, HFM25+  and HFM50+  diets). The  use of  PBM and  HFM  at  25%  (Sparus aurata). Appl. Sci. 2021, 11, 8806.  fishmeal replacement generated a similar hepatic histomorphology to FM‐fed fish, indicating that  https://doi.org/10.3390/app11198806  both land animal proteins are highly digestible at low FM replacement levels. However, 50% and  100% FM replacement levels by either PBM or HFM resulted in pronounced hepatic alterations in  Academic Editor: Simona Picchietti  fish  with  the  latter  causing  more  severe  degradation  of  the  liver.  Dietary  amino  acid  supplementation delivered an improved tissue histology signifying their importance at high FM  Received: 28 July 2021  replacement levels. Intestinal microbiota was dominated by Proteobacteria (58.8%) and Actinobacteria  Accepted: 16 September 2021  (32.4%) in all dietary groups, but no specific pattern was observed among them at any taxonomic  Published: 22 September 2021  level. This finding was probably driven by the high inter‐individual variability observed.  Publisher’s  Note:  MDPI  stays  Keywords: nutrition; aquaculture; fishmeal replacement; land animal proteins; histology; intestinal  neutral with  regard  to jurisdictional  claims  in  published  maps  and  microbiota; Sparus aurata  institutional affiliations.  1. Introduction  Copyright:  ©  2021  by  the  authors.  Gilthead seabream (Sparus aurata) is one of the most important carnivorous farmed  Licensee  MDPI,  Basel,  Switzerland.  fish species in European aquaculture with an annual production of approximately 186,000  This article  is an open access article  mt [1]. As aquaculture is becoming the major fish‐food production sector [2] there is a  distributed  under  the  terms  and  search  for  suitable  protein  sources  in  aquafeeds  that  are  alternatives  to  fishmeal  to  conditions of the Creative Commons  enhance its environmental and economic sustainability. Fishmeal was, and in many cases  Attribution  (CC  BY)  license  remains  the  primary  protein  source  for  the  nutrition  of  farmed  fish.  However,  it  has  (http://creativecommons.org/licenses /by/4.0/).  become necessary to use low fishmeal diets because the global availability of fishmeal is  Appl. Sci. 2021, 11, 8806. https://doi.org/10.3390/app11198806  www.mdpi.com/journal/applsci  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  2  of  15  stagnant, especially for those sourced from the wild, and its price has increased [3]. Land  animal proteins, such as hydrolyzed feather meal (HFM) and poultry by‐product meal  (PBM) are currently incorporated in European aquafeeds. After their re‐approval in 2013,  proved to be valuable feedstuffs for dietary fishmeal replacement in the diet of most fish  species [4–6], including gilthead seabream [7,8]. Although the poultry sector is responsible  for a substantial proportion of greenhouse gases emissions [9], these feedstuffs provide a  valuable mean of animal by‐products utilization and upgrade the ecological efficiency of  the whole poultry production process [10]. Thus, the use of land animal proteins could  enhance aquaculture’s sustainability and eco‐efficiency, as these have a more favorable  carbon footprint and a higher environmental efficiency when compared with fishmeal and  plant alternatives [11,12].  Dietary protein manipulations, however, are known to affect the functionality of the  digestive system [13,14]. A functional digestive system is a prerequisite for the optimal  growth of fish with the liver being the main organ of nutrient deposition and metabolism  and the intestine being the primary site of nutrient digestion and absorption. Therefore,  studying any possible effects and alterations in the histomorphology of these tissues is  fundamental for the evaluation of the use of land animal proteins as fishmeal substitutes.  Most studies have focused on the effects of plant proteins as fish meal replacements [15]  with high substitution levels resulting in marked changes in hepatic and intestinal tissues,  such a reduced number of goblet cells, lipid accumulation in hepatocytes, shorter and  thinner mucosal folds and villi, steatosis, submucosal layer hypertrophy and impaired  structural integrity of the gut [13,15–17]. These alterations are mainly due to the presence  of various anti‐nutritional factors [18] which in turn cause pathophysiological changes in  the gastrointestinal tract and reduce nutrient digestibility.  On the other hand, very little is known about the effects of land animal proteins as  fishmeal  replacements  on the liver  and  intestinal  histology.  Findings  from  the  limited  studies that have been reported up to date have revealed that high inclusion levels of land  animal proteins may induce hepatic steatosis and increase hepatic lipid vacuolization in  Lateolabrax japonicus [19], in hybrid grouper [20,21] and in Lates calcarifer [22]. In addition,  negative  effects  on  the  intestinal  histology  have  also  been  reported  with  the  fishmeal  replacement by land animal proteins [22,23].  Gut microbes are essential for host nutrition and immunity [24] and changes in their  community composition are related to stress and dysbiosis. Fish gut microbes are linked  to the diet since different microbiota persist under different nutritional conditions along  with  the  different  enzymes  produced  (proteases,  lipases,  esterases,  cellulases)  that  contribute to better food digestion by the host [25,26]. It has been shown that the use of  alternative protein sources can alter the gut microbiome of the host having a beneficial  impact on growth and immunity by triggering lactic acid bacteria (LAB) and cytokines  respectively [27].  The present study addressed the effects of poultry by‐product meal and hydrolyzed  feather meal on liver and intestinal histomorphology and on the intestinal microbiota of  gilthead seabream (Sparus aurata).  2. Materials and Methods  All experimental procedures were conducted according to the guidelines of the EU  Directive 2010/63/EU regarding the protection of animals used for scientific purposes. The  experiments were performed at the registered experimental facility (EL‐43BIO/exp‐01) of  the Laboratory of Aquaculture, Department of  Ichthyology and Aquatic Environment,  University of Thessaly by FELASA accredited scientists (functions A–D).  2.1. Feeding Trials and Experimental Diets  Two feeding trials were conducted in which the growth data were not the object of  the present study and are described in detail elsewhere [7,8]. Briefly, gilthead sea bream  (S.  aurata)  juveniles  were  raised  in  glass  tanks  (125  L)  with  recirculating  seawater  of  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  3  of  15  standard water quality (21.0 ± 1.0 °C, pH at 8.0 ± 0.4, salinity at 33 ± 0.5 g/L, dissolved  oxygen at >6.5 mg/L, total ammonia nitrogen at <0.1 mg/L). In feeding trial I, juveniles  with an initial mean weight of 2.5 ± 0.2 g were raised in quadruplicate groups (25 fish/tank,  4  tanks/dietary  group).  For  100  days  they  were  fed  to  satiation  with  one  of  the  five  isonitrogenous (50%) and isoenergetic (21 KJ/Kg) experimental diets [7,8], where the FM  protein  of  the  control  diet  (FM  diet)  was  replaced  by  either  poultry  by‐product  meal  (PBM) at 50% (PBM50 diet) and 100% (PBM100 diet) or by hydrolyzed feather meal (HFM)  at 50% (HFM50 diet) and 100% (HFM100 diet). In feeding trial II, juveniles with an initial  mean weight of 2.9 ± 0.3 g were raised in triplicate groups (25 fish/tank, 3 tanks/dietary  group). For 110 days they were fed to satiation with one of the seven isonitrogenous (50%)  and isoenergetic (21 KJ/Kg) experimental diets [7,8]. These diets used the same FM control  diet as before, but the FM protein was now replaced by PBM and HFM at lower levels:  25% without amino acid supplementation (PBM25 and HFM25 diets), 25% supplemented  with lysine and methionine ((PBM25+ and HFM25+ diets), and 50% supplemented with  lysine and methionine (PBM50+ and HFM50+ diets). At the end of each feeding trial, fish  were weighed individually and euthanized with an overdose of tricaine methanesulfonate  (MS 222, 300+ mg/L) according to the Directive 2010/63/EU and FELASA guidelines.  2.2. Histological Analysis and Measurements  For  the  feeding  trial  I,  two  fish  per  tank  were  randomly  sampled  (eight  fish  per  dietary  group).  The  liver  of  each  fish  was  removed  quickly  and  weighed  for  the  determination of hepatosomatic index. Liver and midgut samples were collected from  each fish, fixated into 10% formalin in filtered seawater for 24 h at 4 °C and then were  immediately dehydrated in graded series of ethanol, immersed in xylol, and embedded  in paraffin wax. Intestinal samples from the HFM100 group were not taken because the  fish  intestine  was  too  thin.  A  part  of  the  liver  of  fish  was  also  collected  for  the  determination of its fat content by exhaustive Soxhlet extraction using petroleum ether on  a  Soxtherm  Multistat/SX  PC  (Sox‐416  Macro,  Gerhard,  Germany).  Liver  and  intestine  sections of 4–7 μm were taken and stained with hematoxylin and eosin. All sections were  examined  under  a  microscope  (Bresser  Science  TRM  301,  Bresser  GmbH,  Rhede,  Germany) and any histological abnormalities were recorded. A digital camera (Bresser  MikroCam 5.0 MP, Bresser GmbH, Rhede, Germany) adjusted to the microscope was used  for  acquiring  histological  section  images.  For  feeding  trial  II,  2  fish  per  tank  were  randomly sampled (six fish per dietary group). The same procedures as in the feeding  trial I were followed for histological examination.  A  semi‐quantitative  grading  system  was  used  in  order  to  quantify  the  histopathological  alterations  of  the  examined  tissues  [28].  Severity  grading  used  the  following system: Grade 0 (not remarkable), Grade 1 (minimal), Grade 2 (mild), Grade 3  (moderate), Grade 4 (severe).  2.3. Microbiota Analysis‐DNA Extraction, Bioinformatics and Data Analysis  In  the  present  study,  the  effect  of  PBM  and  HFM  on  the  intestinal  microbiota  of  juvenile  S.  aurata  was  investigated  at  the  50%  FM  replacement  level  that  negatively  affected the fish growth performance see [7,8]. Thus, for the microbiota analysis fish from  PBM50 and HFM50 groups of the feeding trial I were used. Two fish per tank (eight fish  per  dietary  group)  were  randomly  sampled  and  dissected  using  sterile  lancets  and  forceps. The midgut was transferred in sterile particle‐free (<0.2 mL) sea water (SPFSW).  The gut’s contents were extruded by mechanical force with forceps, as we targeted the  resident gut microorganisms and not the ones associated with the ingested food. DNA  extraction and 454 tag‐pyrosequencing were performed as shown at Nikouli et al. [29].  Processing  of  the  resulting  sequences,  i.e.,  trimming  and  quality  control,  was  performed with the MOTHUR software (v 1.35.0 open access, University of Michigan, MI,  USA) [30]. Only sequences with ≥250 bp and no ambiguous or no homopolymers ≥8 bp  were considered for further analysis. These sequences were aligned and classified using  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  4  of  15  the SILVA SSU database (release 119) [31]. All sequences were binned into Operational  Taxonomic  Units  (OTUs)  and  were  clustered  (average  neighbor  algorithm)  at  97%  sequence similarity. Coverage values were calculated with MOTHUR (v 1.35.0). The batch  of  sequences  from  this  study  has  been  submitted  in  NCBI  Short  Read  Archive  under  accession  number  SRS1839183.  The  heatmaps  of the  dominant  OTUs  and  orders  were  implemented by the pheatmap function in the pheatmap package in R version 3.0.2). For  the  prediction  of  abundant  metabolic  pathways  the  Piphillin  algorithm  [http://secondgenome.com/Piphillin (accessed on 1 October 2020)] was used with support  of KEGG database [32].  2.4. Statistical Analysis  For  the  microbiota  analysis,  canonical  correspondence  analysis  (CCA)  was  performed using the R package vegan [33]. Similarly, the significance of morphological  parameters and diversity indices for the ordination of the samples was calculated using  the  function  envfit  of  the  same  package.  Differentially  abundant  categories  (taxa  or  subsystems)  between  samples  were  identified  with  DESeq  package  version  1.14.0  [34]  using the binomial test and false discovery rate (p < 0.05). For liver fat data, percentages  were subjected to one‐way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s post‐hoc  test to rank the groups using SPSS 18.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).  3. Results  3.1. Liver Histology  In fish fed the control FM diets only minimal alterations (grade 1) were detected in  their  hepatic  tissues  (Table  1,  Figures  1A  and  2A).  In  general,  the  liver  had  normal  structure with central hepatocytes’ nuclei and a small amount of lipid droplets in their  hepatocytes cytoplasm. In some of the hepatocytes the nuclei were not central but pressed  against the periphery of the cells. In the cytoplasm of the exocrine pancreas’ pyramidal  cells many large eosinophilic zymogen granules were observed. Fish fed the diets with  low  inclusion  levels  of  PBM  (PBM25  and  PBM25+  diets)  showed  a  similar  histomorphology to that of the control FM group (Figure 1B,C) and only two fish of the  PBM25+ group showed large lipid droplets around pancreatic islets (Figure 1D). Fish fed  the diets with a higher inclusion level of PBM, had mild (PBM50 fish, grade 2, Figure 1E)  to  moderate  (PBM100  fish,  grade  3,  Figure  1F)  alterations.  The  latter  group  had  also  increased signs of degeneration (Figure 1F). In some of the hepatocytes, the nuclei were  not  central  but  pressed  against  the  periphery  of  the  cells  (Figure  1E).  Within  the  hepatocytes,  medium  size  lipid  droplets  were  observed,  but  no  steatosis  or  liver  hemorrhage signs were detected to any fish. The liver histomorphology of fish fed the  PBM50+ diet that was supplemented with lysine and methionine was slightly better than  that of PBM50 fish.  Table 1. Severity score (0–4) for the observed histopathological alterations and liver fat (% of dry weight) in S. aurata fed  the experimental diets.    FM  PBM25  PBM25+  PΒM50  PBM50+  PBM100  HFM25  HFM25+  HFM50  HFM50+  HFM100  Severity score  Liver  1  1  1  2  2  3  1  1  3  2  4  Intestine  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  0  Liver fat (%)  38.0  36.2  40.6  42.0  43.2  42.5  35.7  36.9  42.7  40.8  7.8  As far as the effect of dietary hydrolyzed feather meal is concerned, fish fed with high  inclusion  levels  of  HFM  showed  moderate  (grade  3,  HFM50  fish)  to  severe  (grade  4,  HFM100 fish) alterations in their liver tissue (Figure 2C,D). These fish showed enlarged  lipid  droplets,  signs  of  pancreatic  islets  necrosis  and  hemorrhage,  which  were  more  intense  in  the  HFM100  fish.  Moreover,  the  latter  fish  showed  signs  of  liver  cirrhosis  (Figure 2D) with the regenerative nodules of hepatocytes to be surrounded by fibrous  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  5  of  15  connective  tissue.  The  supplementation  of  lysine  and  methionine  at  the  HFM50+  diet  resulted in less hepatic alterations (grade 2) and a normal hepatic structure compared to  the HFM50 fish, but still large lipid droplets and more hepatocytes with no central nuclei  were detected in these fish (Figure 2F). However, the replacement of fishmeal by HFM at  lower  levels  (HFM25,  HFM25+)  resulted  in  a  normal  liver  histomorphology  that  was  similar to that of the control FM group (Figure 2B,E).  Figure 1. Liver histopathological examination of S. aurata fed on PBM diets. (A) fish fed FM diet— normal liver structure; (B) fish fed PBM25 diet—normal liver structure; (C) fish fed PBM25+ diet— normal liver structure; (D) fish fed PBM25+ diet—large lipid droplets (*) around pancreatic islets in  some fish; (E) fish fed PBM50 diet—medium size lipid droplets with some nuclei pressed against  the periphery of the cells; (F) fish fed PBM100 diet—liver degeneration.  Figure 2. Liver histopathological examination of S. aurata fed on HFM diets. (A) fish fed FM diet— normal liver structure; (B) fish fed HFM25 diet—normal liver structure; (C) fish fed HFM100 diet— hemorrhage signs (*) and large lipid droplets (arrows); (D) fish fed HFM100 diet—signs of liver  cirrhosis; (E) fish fed HFM25+ diet—normal liver structure; (F) fish fed HFM50+ diet—hepatocytes  with no central nuclei were detected.  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  6  of  15  3.2. Intestinal Histology  All the experimental groups of fish of both feeding trials revealed a normal intestinal  histology  and  none  of  them  showed  any  signs  of  inflammation  (Figures  3  and  4).  Enterocytes were distinct, while goblet cells and apical epithelial vacuoles were normally  present  (Figure  3A).  In  addition,  abundant  eosinophils  cells  were  normally  observed  within the submucosa layer of all fish (Figure 3B).  Figure 3. Midgut histopathological examination of S. aurata fed on PBM diets. (A) fish fed FM diet— normal gut structure with goblet cells (*) present; (B) fish fed PBM50 diet—eosinophil cells (arrow)  accumulation  within  the  muscularis  layer.  Abundant  eosinophils  cells  were  normally  observed  within the submucosa layer (arrowhead); (C) fish fed PBM25 diet—normal structure; (D) fish fed  PBM100 diet—normal structure with goblet cells (*) present.  Figure 4. Midgut histopathological examination of S. aurata fed on HFM diets. (A) fish fed FM diet;  (B) fish fed HFM50 diet; (C) fish fed HFM25 diet; (D) fish fed HFM50+ diet. In all images, the gut  structure appeared normal with goblet cells (*) present.  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  7  of  15  3.3. Intestinal Microbiota  The gut bacterial diversity of fish was studied using 454‐pyrosequencing. From the  24  samples  analyzed  in  total  only  eight  provided  a  satisfactory  number  of  sequences  (>100) combined with coverage >90% (Table 2). Taxonomic and potential species habitat  origin  was  further  studied,  as  well  as  similarities  between  the  bacterial  community  composition (BCC) of the different dietary groups. A total of 125 Operational Taxonomic  Units (Figure 5A) were identified from all 454 datasets, containing 5876 rRNA sequences  in  total  (Table  2).  Coverage  was  above  95%  for  all  samples,  while  diversity  was  low  (Shannon <3) in all samples with the lowest values (<2) being observed in the FM‐fed fish  (Table 2).  Table 2. Sequencing results, diversity indices and coverage values of fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets.  FMa  FMb  HFMa  HFMb  HFMc  HFMd  PBMa  PBMb  Richness  14  14  48  29  14  28  15  16  Sequences  2283  132  2206  325  196  181  234  319  Shannon  1.32  1.71  2.27  2.97  2.05  2.87  2.10  2.23  Cumulative abundance >1%  99.21  96.21  92.84  97.54  97.45  97.24  98.72  98.12  Coverage  1.00  0.95  0.99  0.99  0.97  0.97  0.99  0.99      (A)  (B)  Figure 5. (A) Venn diagram showing shared and unique OTUs between the dietary groups (FM,  PBM50 and HFM50); (B) Morisita similarities between fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets.  Morisita  similarities  between  samples  were  very  low  (<50%)  showing  no  specific  pattern according to the different diet fed (Figure 5B). Canonical correspondence analysis  also exhibited no pattern among fish of either the same or of a different dietary group but  revealed the importance of body weight for the ordination of the samples (p < 0.05) (Figure  6). At the phylum level, all samples were characterized by Proteobacteria and Actinobacteria,  which were the most abundant in almost all fish, as well as by Bacteroidetes and Firmicutes  (Figure  7A).  At  the  OTU  level,  a  total  number  of  64  OTUs  were  detected  in  relative  abundances >1% in at least one fish. Overall, these OTUs accounted for more than 97% of  the total diversity in all samples (Table 2). Similarly, OTUs with relative abundance >10%  clearly representing persistent members of BCC reached cumulative abundances >50% in  all  samples  (Figure  7B)  and  represented  different  species  of  Alpha‐,  Beta‐,  Gamma‐ proteobacteria, Actinobacteria, Flavobacteria, Bacilli and Clostridia (Figure 7B). In total, 6 OTUs  were  shared  amongst  all  dietary  groups  (Figure  5)  and  belonged  to  the  genera  Staphylococcus, Pseudomonas, Delftia, Cutibacterium and Hydrogenophaga (Figure 7B). Most  of them (5) belonged to the abundant species that dominated (>10%) at least in one sample  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  8  of  15  (Figure 7B). The cumulative abundances of this ‘core’ microbiome that was identified from  habitat ranged from 6.1% (HFMa) to 99.2% (FMa) (Figure 7B). The lowest values for core  microbiome  relative  abundances  were  observed  in  the  HFM  fish  with  an  average  of  20.15% contrary to 63.34% and 43.81% in the FM and PBM fish, respectively. This was  attributed to the unique abundant species that were detected in the HFM fish, belonging  to  different  Actinobacteria,  such  as  Propiomicromonospora  and  to  other  species,  such  as  Roseomonas and Sphingomonas.  Figure 6. Canonical correspondence analysis for fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets. Only  factors with significant values (p < 0.05) are presented.  (A)  (B)  Figure 7. (A) Relative abundances of different bacterial phyla in fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets; (B) Relative  abundances of abundant (>10%; left axis) and shared (between treatments) OTUs (right y‐axis) in fish fed the FM, PBM50  and HFM50 diets.  Differences in predicted functional pathways based on the bacterial abundance did  not  exhibit  any  significant  grouping  of  the  samples  based  on  the  different  diet  fed.  However, some pathways were found to be significantly different (p < 0.05) among the  different  dietary  groups  (Figure  8).  Overall,  pathways  for  renin‐angiotensin  system,  retinol metabolism and cAMP signaling were decreased in fish fed the FM diet compared  to those fed either the HFM or the PBM diet. This suggests gut dysbiosis in the two latter  groups  and  possibly  an  effort  to  use  alternative  carbon  sources.  Steroid  degradation  pathways showed a statistically significant increase in the HFM fed fish, indicating that  microbial communities were using alternative carbon sources.  PBM HFM FM Appl. Sci. 2021, 11, 8806  9  of  15  Renin-angiotensin_system_[PATH:ko04614] cAMP_signaling_pathway_[PATH:ko04024] Retinol_metabolism_[PATH:ko00830] Sesquiterpenoid_and_triterpenoid_biosynthesis_[PATH:ko00909] Lipopolysaccharide_biosynthesis_[PATH:ko00540] Betalain_biosynthesis_[PATH:ko00965] Biofilm_formation_-_Pseudomonas_aeruginosa_[PATH:ko02025] Steroid_degradation_[PATH:ko00984] Figure 8. Significantly different (p < 0.05) predicted functional pathways of the bacterial relative  abundances between fish fed the FM, PBM50 and HFM50 diets.  4. Discussion  Non‐ruminant processed animal proteins, such as hydrolyzed feather meal (HFM)  and  poultry  by‐product  meal  (PBM)  have  been  used  successfully  to  replace  fishmeal  protein in the diets of several farmed fish and crustacean species [5–8,35–39]. However,  knowledge of their effects on the histology of digestive organs, the intestinal microbiota  and digestive physiology is extremely limited. Histology is a valuable tool that is used to  describe tissue alterations and to detect any possible pathological signs in fish that may  be caused by dietary protein modifications. In addition, intestinal microbiota profiling  may assess fish intestinal function, health and nutrition [40,41].  4.1. Liver Histology  In the present study, the inclusion of poultry by‐product meal or hydrolyzed feather  meal caused no to severe alterations in the hepatic tissue of S. aurata and these alterations  were  dependent  on  the level  of fishmeal  protein  replacement.  Neither  PBM  nor  HFM  altered  the  liver  histomorphology  of  seabream  when  these  animal  proteins  replaced  fishmeal at 25%. However, at higher replacement levels more lipid droplets and increased  hepatic vacuolization were observed, and these changes were more pronounced in fish  fed HFM diets. In general, high inclusion levels of PBM caused mild to moderate hepatic  alterations compared to the high inclusion levels of HFM that caused severe alterations,  particularly in the case of total fishmeal replacement. Although there were no signs of  steatosis,  which  may  be  caused  by  the  increased  lipid  vacuolization,  the  total  FM  replacement by HFM, contrary to PBM, led to haemorrhage, pancreatic islet necrosis and  cirrhosis in a substantial number of fish that were examined. The dietary supplementation  of PBM and HFM with essential amino acids, such as lysine and methionine, seemed to  improve the digestive physiology. Fish fed these diets showed fewer hepatic alterations  and abnormalities compared to fish fed diets of a similar replacement level but without  amino acid supplementation.  The present findings contradict with those reported by Sabbagh et al. [42] in which  the  100%  replacement  of  FM  by  PBM  did  not  cause  any  liver  alteration  in  S.  aurata.  Although in both studies the total FM replacement by PBM did not lead to any clear signs  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  10  of  15  of  steatosis,  the  mild  increase  in  lipid  vacuolization  with  the  increase  of  PBM  dietary  inclusion observed in the current study may indicate a lower lipid digestibility of the PBM  fat. This indication is supported by the fact that fish fed diets with high inclusion levels of  PBM had increased fat in their livers (Table 1), although this cannot be clearly said for the  HFM fed fish. It has been suggested that that a hepatic lipid accumulation may occur  because the excessive dietary intake of lipids that surpasses the physiological capability  of  the  liver  to β‐oxidize  them,  thus  leading  to  larger  lipid  droplets  and  subsequent  steatosis [43]. However, in our study the dietary lipid intake of PBM and HFM fed fish  was lower than that of FM fed fish see [7,8], which indicates that dietary lipids, specifically  of PBM and HFM lipids, inducehepatic lipid accumulation in S. aurata.  Increased lipid droplets and hepatic vacuolization with signs of inflammation have  also been reported in Lates calcarifer [22,44] and in Tinca tinca [45] when the FM in the fish  fed diets were completely replaced  with PBM. Moreover, Zhou  et al. [21]  reported an  induced steatosis in the hepatocytes of hybrid grouper even when fish were fed diets with  50–70% FM replacement levels by PBM. On the other hand, the total replacement of FM  by PBM did not cause any increased vacuolization or alterations in the hepatocytes of  Salmo salar [14] and of Oreochromis niloticus [46]. The effects of dietary HFM as a sole FM  replacement on fish  liver histomorphology are not well studied. Hartviksen et al. [14]  stated that a diet with total FM replacement by HFM did not reveal signs of steatosis in  Salmo salar with hepatocytes having even a lower fat accumulation than to those fed on  FM. Studies using HFM in a blend with other animal proteins, including PBM, for FM  replacement  have  reported  that  high  substitution  levels  induce  hepatic  lipidosis  and  steatosis in Lateolabrax japonicus [19] and in hybrid grouper [20].  4.2. Intestinal Histology  The inclusion of poultry by‐product meal or hydrolyzed feather meal did not cause  any intestinal histological alterations in seabream compared to fish fed the FM‐based diet.  All fish showed distinct enterocytes with abundant eosinophils cells, with goblet cells and  apical epithelial vacuoles being present along the entire intestine of fish. Goblet cells assist  fish health and nutrition as the mucus secreted by them acts as a protection medium to  the epithelium, while also lubricates undigested materials for onward progression into  the  rectum  [47,48].  Moreover,  apical  epithelial  vacuoles  consist  integral  structural  components of the intestine that are responsible for nutrient absorption [49]. Although the  present findings do not provide a sufficient evidence for the absorption of PBM and HFM,  it can be claimed that these land animal proteins did not result in signs of malnutrition or  inflammation, such as enteritis. This applies for all tested FM replacement levels, except  for total replacement by HFM which was not feasible to examine. Similarly, an unaffected  intestinal histology was reported in Atlantic salmon fed on high levels of PBM [50] and in  Nile tilapia fed on high levels of HFM [51] replacing dietary FM. Hartviksen et al. [14]  working  with  Atlantic  salmon  reported  no  severe  signs  of  enteritis  and  unaffected  numbers  of  eosinophilic  granular  cells  in  fish  fed  either  with  PBM  or  HFM  replacing  dietary fishmeal at a level close to 50%. However, the authors reported that PBM led to a  decreased submucosa width, while HFM led to a decreased presence of goblet cells and  an increased presence of apical epithelial vacuoles in the intestine. Moreover, Chaklader  et al. [22] reported a dysregulated intestinal morphology with smaller microvilli of shorter  diameter  in  juvenile  barramundi  fed  on  PBM  totally  replacing  dietary  fishmeal.  Furthermore,  Yu  et  al.  [23]  working  with  Pengze  crucian  carp  reported  shortened  microvillus and enterocytes and thinner muscular thickness when HFM replaced more  than 30% of dietary fishmeal protein.  4.3. Intestinal Microbiota  Regarding the dietary effects on the intestinal microbiota, it can be argued that no  clear effects were detected from the use of HFM or PBM. The gut Bacterial Community  Composition (BCC) of S. aurata fed either FM, PBM or HFM was characterized by groups  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  11  of  15  that  are  commonly  found  in  the  fish  gut  microbiome.  The  core  genera  Pseudomonas,  Cutibacterium,  Staphylococcus  and  Delftia  have  been  previously  reported  as  core  microbiome  of  S.  aurata  farmed  in  several  geographical  sites  [29,52],  suggesting  that  certain bacterial genera are capable of colonizing the seabream gut independently of the  diet and location. Similar findings have been reported for Salmo salar [41] with authors  stating  that  the  role  of  fish‐hosts  in  selecting  or  promoting  core  microbes  is  unclear.  Actinobacteria species were dominant and unique in the HFM fed fish and their dominance  could  be  related  to  their  antimicrobial  functions  (i.e.,  antibiotics)  that  protect  the  host  [53,54]. Additionally, the prevalence of terpenoid biosynthesis genes that were prevalent  in the HFM fed fish is mostly detected in Actinobacteria [55] and was in accordance with  the taxonomic BCC (Figure 7A,B). The Sphingomonas species in the gut have been found  to be negatively correlated with weight gain [56] which also agrees with our CCA data  (Figure 6).  The predicted pathways that were enriched in the HFM and PBM fed fish compared  to FM fed fish were mostly related to functions that imply gut dysbiosis. For instance,  increased  renin‐angiotensin  system  (RAS)  genes  have  been  related  to  RAS  system  activation which implies malnutrition [57,58]. Gut dysbiosis that promotes RAS activation  is mostly related to decreased abundances of fermenting bacteria, which was the case in  the HFM and PBM groups of fish. Similarly, bacterial retinol metabolism predicted genes  indicate  a  potential  need  for  vitamin  A  production  that  enhances  mucosal  immunity.  Thus, bacteria able to participate in retinol metabolism also assist in avoiding pathogen  invasion [59].  Knowledge of the effects of fishmeal replacement  by land animal proteins on the  intestinal microbiota is extremely limited. In the present study, as stated above, there was  no specific  pattern in  the bacterial  communities among fish fed  either fishmeal or the  tested  land  animal  proteins.  Gajardo  et  al.  [41],  working  with  Salmo  salar,  reported  a  significant effect of the dietary PBM on the distal intestine digesta and mucosa. This study  found significantly higher and lower abundances of specific genera in fish fed PBM than  in  fish  fed  on  a  FM‐based  diet.  Hartviksen  et  al.  [14],  also  working  with  Salmo  salar,  reported  that  the  use  of  HFM  and  PBM  as  fishmeal  replacements  increased  the  total  allochthonous  and  total  autochthonous  bacteria  in  the  distal  intestine,  but  the  total  autochthonous bacteria in the proximal intestine remained unaffected. The authors also  reported that the supplementation of HFM caused significant increases in specific genera  (Corynebacteriaceae, Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Pseudomonadaceae, Xanthomonadaceae)  and  decreases  in  another  (Vibrionaceae).  Furthermore,  PBM  caused  increases  in  Corynebacteriaceae  and  decreases  in  b‐Proteobacteria,  Bacilli‐like,  Peptostreptococcaceae  and  Vibrionaceae.  Certainly,  a  better  understanding  of  the  functional  roles  of  the  intestinal  microbiota communities of fish and to what extent these are affected by the use of land  animal proteins is needed.  5. Conclusions  In  conclusion,  fishmeal  replacement  by  either  poultry  by‐product  meal  or  hydrolyzed feather meal did not cause any intestinal histological alterations. Thus, these  results indicate normal digestion and absorption in the midgut of S. aurata even when  their dietary fishmeal protein is completely replaced. Neither land animal proteins altered  the  liver  histomorphology  of  gilthead  seabream  when  fishmeal  was  replaced  at  25%.  However, at higher replacement levels increased lipid droplets and hepatic vacuolization  were  observed  to  be  more  pronounced  in  fish  fed  HFM  diets.  Moreover,  the  dietary  supplementation  of  PBM  and  HFM  with  essential  lysine  and  methionine  seemed  to  improve the digestive physiology, as fish fed these diets showed fewer hepatic alterations  and abnormalities compared to diets of a similar replacement level but without amino  acid supplementation. The dominant phyla in the intestinal microbiota were Proteobacteria  (58.8%)  and  Actinobacteria  (32.4%),  but  no  specific  pattern  was  observed  among  the  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  12  of  15  different dietary fish groups at any taxonomic level. This finding was probably driven by  the high inter‐individual variability observed.  Author Contributions: Conceptualization, I.T.K., E.M. and K.A.K.; Methodology, P.P., A.M. and  P.B.; Software, P.P., A.M. and P.B.; Validation, I.T.K., E.M. and K.A.K.; Formal Analysis, P.P., A.M.  and P.B.; Investigation, P.P., A.M. and P.B.; Resources, I.T.K., E.M., P.B. and K.A.K.; Data Curation,  I.T.K., K.A.K. and E.M.; Writing—Original Draft Preparation, P.P. and A.M.; Writing—Review &  Editing,  I.T.K.,  P.B.,  K.A.K.,  E.M.;  Supervision,  I.T.K.,  E.M.  and  K.A.K.;  Project  Administration,  I.T.K.; Funding Acquisition, I.T.K. All authors have read and agreed to the published version of the  manuscript.  Funding: This research was funded by the Operational Programme “Fisheries 2007–2013” (Ministry  of  Rural  Development  and  Food  of  the  Hellenic  Republic/European  Fisheries  Fund)  under  the  project  title  “The  use  of  Processed  Animal  Proteins  in  the  feeds  of  gilt‐head  seabream  (Sparus  aurata)”, Grant Number: 2014ΣΕ086800090000.  Institutional Review Board Statement: The study was conducted according to the guidelines of EU  legal frameworks related to the welfare and protection of animals for scientific purposes (Directive  2010/63/EU) and in strict accordance with the University of Thessaly’s Ethics Committee on the Use  of Animals in Research (protocol approval 20 December 2016).  Informed Consent Statement: Not applicable  Data Availability Statement: The data presented in this study are available on request from the  corresponding author  Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.  References  1. FAO. The State of World Fishery and Aquaculture 2020 (SOFIA); Food and Agriculture Organization of the United Nations: Rome,  Italy, 2020; doi:10.4060/ca9229en.  2. Cultured  Aquatic  Species  Information  Programme.  Sparus  aurata  (Linnaeus,  1758).  FAO.  Available  online:  http://www.fao.org/fishery/culturedspecies/Sparus_aurata/en (accessed on 24 July 2021).  3. Jannathulla, R.; Rajaram, V.; Kalanjiam, R.; Ambasankar, K.; Muralidhar, M.; Dayal, J.S. Fishmeal availability in the scenarios  of climate change: Inevitability of fishmeal replacement in aquafeeds and approaches for the utilization of plant protein sources.  Aquac. Res. 2019, 50, 3493–3506.  4. Yu,  H.‐R.;  Zhang,  Q.;  Cao,  H.;  Wang,  X.‐Z.;  Huang,  G.‐Q.;  Zhang,  B.‐R.;  Fan,  J.‐J.;  Liu,  S.‐W.;  Li,  W.‐Z.;  Cui,  Y.  Apparent  digestibility coefficients of selected feed ingredients for juvenile snakehead, Ophiocephalus argus. Aquac. Nutr. 2012, 19, 139–147,  doi:10.1111/j.1365‐2095.2012.00947.x.  5. González‐Rodríguez, Á.; Celada, J.D.; Carral, J.M.; Sáez‐Royuela, M.; García, V.; Fuertes, J.B. Evaluation of poultry by‐product  meal as partial replacement of fish meal in practical diets for juvenile tench (Tinca tinca L.). Aquac. Res. 2014, 47, 1612–1621,  doi:10.1111/are.12622.  6. Campos,  I.;  Matos,  E.;  Marques,  A.;  Valente,  L.M.  Hydrolyzed  feather  meal  as  a  partial  fishmeal  replacement  in  diets  for  European seabass (Dicentrarchus labrax) juveniles. Aquaculture 2017, 476, 152–159, doi:10.1016/j.aquaculture.2017.04.024.  7. Karapanagiotidis, I.T.; Psofakis, P.; Mente, E.; Malandrakis, E.; Golomazou, E. Effect of fishmeal replacement by poultry by‐ product meal on growth performance, proximate composition, digestive enzyme activity, haematological parameters and gene  expression of gilthead seabream (Sparus aurata). Aquac. Nutr. 2019, 25, 3–14, doi:10.1111/anu.12824.  8. Psofakis, P.; Karapanagiotidis, I.; Malandrakis, E.; Golomazou, E.; Exadactylos, A.; Mente, E. Effect of fishmeal replacement by  hydrolyzed  feather  meal  on  growth  performance,  proximate  composition,  digestive  enzyme  activity,  haematological  parameters  and  growth‐related  gene  expression  of  gilthead  seabream  (Sparus  aurata).  Aquaculture  2020,  521,  735006,  doi:10.1016/j.aquaculture.2020.735006.  9. Enzing, C.; Ploeg, M.; Barbosa, M.; Sijtsma, L. Microalgae‐Based Products for the Food and Feed Sector: An Outlook for Europe; Report  EUR 26255; Publications Office of the European Union: Luxembourg, 2014.  10. Maiolo, S.; Parisi, G.; Biondi, N.; Lunelli, F.; Tibaldi, E.; Pastres, R. Fishmeal partial substitution within aquafeed formulations:  Life cycle assessment of four alternative protein sources. Int. J. Life Cycle Assess. 2020, 25, 1455–1471, doi:10.1007/s11367‐020‐ 01759‐z.  11. den Hartog, L.A.; Sijtsma, S.R. Sustainable feed ingredients. In Proceedings of the 12th International Symposium of Australian  Renderers Association “Rendering for Sustainability”, Victoria, Australia, 23–26 July 2013; pp. 18–26.  12. Maiolo,  S.;  Cristiano,  S.;  Gonella,  F.;  Pastres,  R.  Ecological  sustainability  of  aquafeed:  An  emergy  assessment  of  novel  or  underexploited ingredients. J. Clean. Prod. 2021, 294, 126266, doi:10.1016/j.jclepro.2021.126266.  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  13  of  15  13. Martínez‐Llorens, S.; Baeza‐Ariño, R.; Nogales‐Mérida, S.; Jover‐Cerdá, M.; Tomás‐Vidal, A. Carob seed germ meal as a partial  substitute in gilthead sea bream (Sparus aurata) diets: Amino acid retention, digestibility, gut and liver histology. Aquaculture  2012, 338‐341, 124–133, doi:10.1016/j.aquaculture.2012.01.029.  14. Hartviksen, M.A.B.; Vecino, J.L.G.; Ringo, E.; Bakke, A.M.; Wadsworth, S.; Krogdahl, A.; Ruohonen, K.; Kettunen, A. Alternative  dietary protein sources for Atlantic salmon (Salmo salar L.) effect on intestinal microbiota, intestinal and liver histology and  growth. Aquac. Nutr. 2014, 20, 381–398, doi:10.1111/anu.12087.  15. Baeza‐Ariño, R.; Martínez‐Llorens, S.; Nogales‐Mérida, S.; Jover‐Cerdá, M.; Tomás‐Vidal, A. Study of liver and gut alterations  in  sea  bream,  Sparus  aurata  L.,  fed  a  mixture  of  vegetable  protein  concentrates.  Aquac.  Res.  2014,  47,  460–471,  doi:10.1111/are.12507.  meal replacement by plant  16. Sitjà‐Bobadilla, A.; Peña‐Llopis, S.; Requeni, P.G.; Médale, F.; Kaushik, S.; Sánchez, J.P. Effect of fish  protein sources on non‐specific defence mechanisms and oxidative stress in gilthead sea bream (Sparus aurata). Aquaculture 2005,  249, 387–400, doi:10.1016/j.aquaculture.2005.03.031.  17. Kokou, F.; Sarropoulou, E.; Cotou, E.; Rigos, G.; Henry, M.; Alexis, M.; Kentouri, M. Effects of Fish Meal Replacement by a  Soybean Protein on Growth, Histology, Selected Immune and Oxidative Status Markers of Gilthead Sea Bream, Sparus aurata.  J. World Aquac. Soc. 2015, 46, 115–128, doi:10.1111/jwas.12181.  18. Krogdahl, Å.; Penn, M.; Thorsen, J.; Refstie, S.; Bakke, A.M. Important antinutrients in plant feedstuffs for aquaculture: An up‐ date on recent findings regarding responses in salmonids. Aquac. Res. 2010, 41, 333–344.  19. Hu, L.; Yun, B.; Xue, M.; Wang, J.; Wu, X.; Zheng, Y.; Han, F. Effects of fish meal quality and fish meal substitution by animal  protein blend on growth performance, flesh quality and liver histology of Japanese seabass (Lateolabrax japonicus). Aquaculture  2013, 372‐375, 52–61, doi:10.1016/j.aquaculture.2012.10.025.  20. Ye, H.; Zhou, Y.; Su, N.; Wang, A.; Tan, X.; Sun, Z.; Zou, C.; Liu, Q.; Ye, C. Effects of replacing fish meal with rendered animal  protein blend on growth performance, hepatic steatosis and immune status in hybrid grouper (Epinephelus fuscoguttatus♀ ×  Epinephelus lanceolatus♂). Aquaculture 2019, 511, 734203, doi:10.1016/j.aquaculture.2019.734203.  21. Zhou, Z.; Yao, W.; Ye, B.; Wu, X.; Li, X.; Dong, Y. Effects of replacing fishmeal protein with poultry by‐product meal protein  and  soybean  meal  protein  on  growth,  feed  intake,  feed  utilization,  gut  and  liver  histology  of  hybrid  grouper  (Epinephelus  fuscoguttatus ♀ × Epinephelus lanceolatus ♂) juveniles. Aquaculture 2020, 516, 734503, doi:10.1016/j.aquaculture.2019.734503.  22. Chaklader, R.; Siddik, M.A.B.; Fotedar, R. Total replacement of fishmeal with poultry by‐product meal affected the growth,  muscle quality, histological structure, antioxidant capacity and immune response of juvenile barramundi, Lates calcarifer. PLoS  ONE 2020, 15, e0242079, doi:10.1371/journal.pone.0242079.  23. Yu, R.; Cao, H.; Huang, Y.; Peng, M.; Kajbaf, K.; Kumar, V.; Tao, Z.; Yang, G.; Wen, C. The effects of partial replacement of  fishmeal protein by hydrolysed feather meal protein in the diet with high inclusion of plant protein on growth performance,  fillet quality and physiological parameters of Pengze crucian carp (Carassius auratus var. Pengze). Aquac. Res. 2019, 51, 636–647,  doi:10.1111/are.14411.  24. Perry,  W.B.;  Lindsay,  E.;  Payne,  C.J.;  Brodie,  C.;  Kazlauskaite,  R.  The  role  of  the  gut  microbiome  in  sustainable  teleost  aquaculture. Proc. R. Soc. B 2020, 287, 20200184.  25. Ray,  A.; Ghosh,  K.; Ringø, E. Enzyme‐producing  bacteria isolated from  fish  gut: A  review.  Aquac.  Nutr.  2012,  18,  465–492,  doi:10.1111/j.1365‐2095.2012.00943.x.  26. Wu, S.; Ren, Y.; Peng, C.; Hao, Y.; Xiong, F.; Wang, G.; Li, W.; Zou, H.; Angert, E.R. Metatranscriptomic discovery of plant  biomass‐degrading  capacity  from  grass  carp  intestinal  microbiomes.  FEMS  Microbiol.  Ecol.  2015,  91,  fiv107,  doi:10.1093/femsec/fiv107.  27. Foysal, J.; Fotedar, R.; Tay, C.‐Y.; Gupta, S.K. Dietary supplementation of black soldier fly (Hermetica illucens) meal modulates  and  gut microbiota, innate immune response and health status of marron (Cherax cainii, Austin 2002) fed poultry‐by‐product  fishmeal based diets. PeerJ 2019, 7, e6891, doi:10.7717/peerj.6891.  28. Johnson, R.; Wolf, J.; Braunbeck, T. OECD Guidance Document for the Diagnosis of Endocrine‐Related Histopathology of Fish Gonads;  Organization  for  Economic  Co‐operation  and  Development  2009;  p.  96. Available  online:  https://www.oecd.org/chemicalsafety/testing/42140701.pdf (accessed on 14 April 2020).  29. Nikouli,  E.;  Meziti,  A.;  Antonopoulou,  E.;  Mente,  E.;  Kormas,  K.A.  Gut  Bacterial  Communities  in  Geographically  Distant  Populations  of  Farmed  Sea  Bream  (Sparus  aurata)  and  Sea  Bass  (Dicentrarchus  labrax).  Microorganisms  2018,  6,  92,  doi:10.3390/microorganisms603009.  30. Schloss, P.D.; Westcott, S.L.; Ryabin, T.; Hall, J.R.; Hartmann, M.; Hollister, E.B.; Lesniewski, R.A.; Oakley, B.B.; Parks, D.H.;  Robinson, C.J.; et al. Introducing mothur: Open‐Source, Platform‐Independent, Community‐Supported Software for Describing  and Comparing Microbial Communities. Appl. Environ. Microbiol. 2009, 75, 7537–7541, doi:10.1128/aem.01541‐09.  31. Pruesse, E.; Quast, C.; Knittel, K.; Fuchs, B.M.; Ludwig, W.; Peplies, J.; Glöckner, F.O. SILVA: A comprehensive online resource  for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 2007, 35, 7188–7196,  doi:10.1093/nar/gkm864.  32. Iwai, S.; Weinmaier, T.; Schmidt, B.L.; Albertson, D.G.; Poloso, N.J.; Dabbagh, K.; DeSantis, T.Z. Piphillin: Improved Prediction  of  Metagenomic  Content  by  Direct  Inference  from  Human  Microbiomes.  PLoS  ONE  2016,  11,  e0166104,  doi:10.1371/journal.pone.0166104.     Appl. Sci. 2021, 11, 8806  14  of  15  33. Oksanen, J.; Blanchet,  F.G.; Friendly, M.;  Kindt,  R.; Legendre, P.; McGlinn,  D.; Minchin,  P.R.; O’Hara, R.B.; Simpson, G.L.;  Solymos, P.; Henry, M.; Stevens, H.; Szoecs, E.; Wagner, H. vegan: Community Ecology Package. Ordination methods, Diversity  Analysis  and  Other  Functions  for  Community  and  Vegetation  Ecologists.  2021.  Available  online:  http://outputs.worldagroforestry.org/cgi‐bin/koha/opac‐detail.pl?biblionumber=39504 (accessed on 27 July 2021).  34. Anders, S.; Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 2010, 11, R106.  35. Li, K.; Wang, Y.; Zheng, Z.X.; Jiang, R.L.; Xie, N.X. Replacing fishmeal with rendered animal protein ingredients in diets for  Malabar grouper, Epinephelus malabaricus, reared in net pens. J. World Aquac. Soc. 2009, 40, 67–75.  36. Hernãndez, C.; Olvera‐Novoa, M.; Hardy, R.; Hermosillo, A.; Reyes, C.; Gonzãlez, B. Complete replacement of fish meal by  porcine and poultry by‐product meals in practical diets for fingerling Nile tilapia Oreochromis niloticus: Digestibility and growth  Aquac. Nutr. 2010, 16, 44–53, doi:10.1111/j.1365‐2095.2008.00639.x.  performance.  37. Hernández, C.; Sanchez‐Gutierrez, Y.; Hardy, R.W.; Benitez‐Hernández, A.; Domínguez‐Jimenez, P.; González‐Rodríguez, B.;  Osuna‐Osuna, L.; Tortoledo, O. The potential of pet‐grade poultry by‐product meal to replace fish meal in the diet of the juvenile  spotted rose snapper Lutjanus guttatus (Steindachner, 1869). Aquac. Nutr. 2014, 20, 623–631, doi:10.1111/anu.12122.  38. Fuertes, J.; Celada, J.D.; Carral, J.M.; Sáez‐Royuela, M.; Gonzalez‐Rodriguez, A. Effects of fishmeal replacement by feather meal  in  practical  diets  for  juvenile  crayfish  (Pacifastacus  leniusculus  Dana,  Astacidae).  Aquac.  Nutr.  2013,  20,  36–43,  doi:10.1111/anu.12044.  39. Zapata, D.B.; Lazo, J.P.; Herzka, S.Z.; Viana, M.T. The effect of substituting fishmeal with poultry by‐product meal in diets for  Totoaba macdonaldi juveniles. Aquac. Res. 2016, 47, 1778–1789.  40. Ringø, E.; Zhou, Z.; Vecino, J.L.G.; Wadsworth, S.; Romero, J.; Krogdahl, Å.; Olsen, R.E.; Dimitroglou, A.; Foey, A.; Davies, S.;  et al. Effect of dietary components on the gut microbiota of aquatic animals. A never‐ending story? Aquac. Nutr. 2016, 22, 219– 282, doi:10.1111/anu.12346.  41. Gajardo, K.; Jaramillo‐Torres, A.; Kortner, T.M.; Merrifield, D.L.; Tinsley, J.; Bakke, A.M.; Krogdahl, Å. Alternative Protein  Sources in the Diet Modulate Microbiota and Functionality in the Distal Intestine of Atlantic Salmon (Salmo salar). Appl. Environ.  Microbiol. 2017, 83, 83, doi:10.1128/aem.02615‐16.  42. Sabbagh, M.; Schiavone, R.; Brizzi, G.; Sicuro, B.; Zilli, L.; Vilella, S. Poultry by‐product meal as an alternative to fish meal in the  juvenile gilthead seabream (Sparus aurata) diet. Aquaculture 2019, 511, 734220, doi:10.1016/j.aquaculture.2019.734220.  43. Spisni, E.; Tugnoli, M.; Ponticelli, A.; Mordenti, T.; Tomasi, V. Hepatic steatosis in artificially fed marine teleosts. J. Fish Dis.  1998, 21, 177–184.  44. Siddik, M.A.B.; Chungu, P.; Fotedar, R.; Howieson, J. Bioprocessed poultry by‐product meals on growth, gut health and fatty  acid synthesis of juvenile barramundi, Lates calcarifer (Bloch). PLoS ONE 2019, 14, e0215025, doi:10.1371/journal.pone.0215025.  45. Panicz, R.; Żochowska‐Kujawska, J.; Sadowski, J.; Sobczak, M. Effect of feeding various levels of poultry by‐product meal on  the  blood  parameters,  filet  composition  and  structure  of  female  tenches  (Tinca  tinca).  Aquac.  Res.  2017,  48,  5373–5384,  doi:10.1111/are.13351.  46. Aydín, B.; Gümüş, E.; Balci, B.A. Effect of dietary fish meal replacement by poultry by‐product meal on muscle fatty acid  composition and liver histology of fry of Nile tilapia, Oreochromis niloticus (Actinopterygii: Perciformes: Cichlidae). Acta Ichthyol.  et Piscat. 2015, 45, 343–351.  47. Deplancke, B.; Gaskins, H.R. Microbial modulation of innate defense: Goblet cells and the intestinal mucus layer. Am. J. Clin.  Nutr. 2001, 73, 1131S–1141S, doi:10.1093/ajcn/73.6.1131s.  48. Berillis, P.; Mente, E. Histology of Goblet Cells in the Intestine of the Rainbow Trout Can Lead to Improvement of the Feeding  Management. J. Fish. 2017, 11, 32–33, doi:10.21767/1307‐234x.1000139.  49. Ferguson, H.W. Systemic pathology of fish. In A Text and Atlas of Comparative Tissue Responses in Diseases of Teleosts, 2nd ed.;  Scotian Press: London, UK, 2006.  50. Hu, H.; Kortner, T.M.; Gajardo, K.; Chikwati, E.M.; Tinsley, J.; Krogdahl, Å. Intestinal Fluid Permeability in Atlantic Salmon  (Salmo salar L.) Is Affected by Dietary Protein Source. PLoS ONE 2016, 11, e0167515, doi:10.1371/journal.pone.0167515.  51. Tran‐Ngoc,  K.T.;  Haidar,  M.N.;  Roem,  A.J.;  Sendão,  J.;  Verreth,  J.;  Schrama,  J.W.  Effects  of  feed  ingredients  on  nutrient  digestibility, nitrogen/energy balance and morphology changes in the intestine of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Aquac. Res.  2019, 50, 2577–2590, doi:10.1111/are.14214.  52. Nikouli, E.; Meziti, A.; Smeti, E.; Antonopoulou, E.; Mente, E.; Kormas, K.A. Gut Microbiota of Five Sympatrically Farmed  Marine Fish Species in the Aegean Sea. Microb. Ecol. 2021, 81, 460–470, doi:10.1007/s00248‐020‐01580‐z.  53. El‐Rhman, A.M.A.; Khattab, Y.A.; Shalaby, A.M. Micrococcus luteus and Pseudomonas species as probiotics for promoting the  growth  performance  and  health  of  Nile  tilapia,  Oreochromis  niloticus.  Fish  Shellfish.  Immunol.  2009,  27,  175–180,  doi:10.1016/j.fsi.2009.03.020.  54. Akayli, T.; Albayrak, G.; Ürkü, Ç.; Çanak, Ö.; Yörük, E. Characterization of Micrococcus luteus and Bacillus marisflavi Recovered  from Common Dentex (Dentex dentex) Larviculture System. Mediterr. Mar. Sci. 2015, 17, 163, doi:10.12681/mms.1322.  55. Yamada,  Y.;  Kuzuyama,  T.;  Komatsu,  M.;  Shin‐Ya,  K.;  Omura,  S.;  Cane,  D.‐E.;  Ikeda,  H.  Terpene  synthases  are  widely  distributed in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, 857–862, doi:10.1073/pnas.1422108112.  56. Dvergedal, H.; Sandve, S.R.; Angell, I.L.; Klemetsdal, G.; Rudi, K. Association of gut microbiota with metabolism in juvenile  Atlantic salmon. Microbiome 2020, 8, 1–8, doi:10.1186/s40168‐020‐00938‐2.  57. Perlot, T.; Penninger, J.M. ACE2—From the renin–angiotensin system to gut microbiota and malnutrition. Microbes Infect. 2013,  15, 866–873.  Appl. Sci. 2021, 11, 8806  15  of  15  58. Lu, C.C.; Ma, K.L.; Ruan, X.Z.; Liu, B.C. Intestinal dysbiosis activates renal renin‐angiotensin system contributing to incipient  diabetic nephropathy. Int. J. Med. Sci. 2018, 15, 816–822, doi:10.7150/ijms.25543.  59. Iyer, N.; Vaishnava, S. Vitamin A at the interface of host‐commensal‐pathogen interactions. PLoS Pathog. 2019, 15, e1007750. 

Journal

Applied Sciences – Multidisciplinary Digital Publishing Institute

Published: Sep 22, 2021

Keywords: nutrition; aquaculture; fishmeal replacement; land animal proteins; histology; intestinal microbiota; Sparus aurata

There are no references for this article.