Get 20M+ Full-Text Papers For Less Than $1.50/day. Start a 14-Day Trial for You or Your Team.

Learn More →

Comparative Metabolic Study of Two Contrasting Chinese Cabbage Genotypes under Mild and Severe Drought Stress

Comparative Metabolic Study of Two Contrasting Chinese Cabbage Genotypes under Mild and Severe... Article  Comparative Metabolic Study of Two Contrasting Chinese  Cabbage Genotypes under Mild and Severe Drought Stress  1 2 1 1 1 1 1 1, Lin Chen  , Yongrui Shen  , Wenjing Yang  , Qiming Pan  , Chao Li  , Qingguo Sun  , Qi Zeng  , Baohua Li  * and  1, Lugang Zhang  *    State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Area, College of Horticulture,   Northwest A&F University, Yangling 712100, China; chenlin1995@nwafu.edu.cn (L.C.);   yangwenjing@nwafu.edu.cn (W.Y.); 2020055340@nwsuaf.edu.cn (Q.P.); lc1999@nwsuaf.edu.cn (C.L.);  qguosun@nwafu.edu.cn (Q.S.); zengqi@nwafu.edu.cn (Q.Z.)    College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;   shenyongrui0926@nwafu.edu.cn  *  Correspondence: baohuali@nwafu.edu.cn (B.L.); lugangzh@nwafu.edu.cn (L.Z.)  Abstract: Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis) is an important leafy vegetable crop cul‐ tivated worldwide. Drought is one of the most important limiting factors for the growth, production  and quality of Chinese cabbage due to its weak drought tolerance. In order to deepen the under‐ standing of drought stress response in Chinese cabbage, metabolomics studies were conducted in  drought−tolerant (DT) and drought−susceptible (DS) genotypes of Chinese cabbage under water  deficit−simulated mild and severe drought stress conditions. A total of 777 metabolites were de‐ tected, wherein 90 of them were proposed as the drought−responsive metabolites in Chinese cab‐ bage, with abscisic acid (ABA), serine, choline alfoscerate, and sphingosine as potential representa‐ tive drought stress biomarkers. We also found that drought−tolerant and drought−susceptible gen‐ otypes  showed  differential  metabolic  accumulation  patterns  with  contrasting  drought  response  mechanisms.  Notably,  constitutively  high  levels  of  ABA  and  glutathione  were  detected  in  Citation: Chen, L.; Shen, Y.; Yang,  drought−tolerant genotype in all tested and control conditions. In addition, proline, sucrose, γ−ami‐ W.; Pan, Q.; Li, C.; Sun, Q.; Zeng, Q.;  nobutyric acid, and glutathione were also found to be highly correlated to drought tolerance. This  Li, B.; Zhang, L. Comparative   study is the first metabolomic study on how Chinese cabbage responds to drought stress, and could  Metabolic Study of Two Contrasting  provide insights on how to develop and cultivate new drought−resistant varieties.  Chinese Cabbage Genotypes under  Mild and Severe Drought Stress. Int.  Keywords: Chinese cabbage; drought stress; metabolome; abscisic acid; glutathione  J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947. https://  doi.org/10.3390/ijms23115947  Academic Editor: Vicent Arbona  Received: 4 May 2022  1. Introduction  Accepted: 23 May 2022  Drought is one of the major environmental factors affecting agricultural production  Published: 25 May 2022  and food security, especially in arid and semi−arid areas where water supply is a major  Publisher’s  Note:  MDPI  stays  neu‐ challenge [1,2]. Thus, developing new crop varieties with low water consumption is crit‐ tral  with  regard  to  jurisdictional  ical for sustaining agriculture and the environment [1].  claims in published maps and institu‐ Chinese cabbage, a fresh leafy vegetable with a high leaf water content and shallow  tional affiliations.  root system, is widely cultivated and consumed around the world, especially in East Asia  where the shortage of fresh water is a major challenge for agriculture. Therefore, it is of    great importance to increase the drought tolerance of Chinese cabbage for its stable pro‐ duction. Genetic and molecular breeding has become increasingly important for improv‐ Copyright: © 2022 by the authors. Li‐ ing drought tolerance of crops, including Chinese cabbage [3,4], and the understanding  censee  MDPI,  Basel,  Switzerland.  of  the  plant’s  drought  response  would  provide  theoretical  framework  for  breeding  This article  is an open access article  drought−resistant varieties.  distributed under the terms and con‐ ditions of the Creative Commons At‐ Plants produce huge numbers of metabolites in order to sustain their growth and  tribution (CC BY) license (https://cre‐ reproduction, as well as adapt to biotic and abiotic stresses. As plants are physically fixed  ativecommons.org/licenses/by/4.0/).  and cannot move, their metabolic responses are key survival tools to deal with various  Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947. https://doi.org/10.3390/ijms23115947  www.mdpi.com/journal/ijms  Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  2  of  18  environment stresses. In recent years, technological advances have been greatly devel‐ oped and utilized to study plants in omics−based approaches, and metabolomics has be‐ come an efficient and important approach to gain panoramic views of how plants respond  to stresses at the whole metabolism level [5,6]. However, there are only RNA−seq studies  of Chinese cabbage’s responses to drought stress on the transcriptional level, while the  metabolic responses at the whole metabolome level have not been reported yet [7–9].  A  large  number  of  metabolomics  studies  have  been  conducted  to  reveal  drought  stress responses in different plant species, and their metabolisms have been significantly  affected by drought stress [10–13]. In Chinese cabbage, previous studies have shown that  drought significantly influences the accumulation of multiple diverse groups of metabo‐ lites including glucosinolates, polyphenols, flavonoids, total antioxidant enzyme activi‐ ties, catalases, and peroxidases in Chinese cabbage [9,14]. Therefore, we propose that Chi‐ nese cabbage may also systemically respond to drought stress at the metabolic level.  In this study, we characterized metabolic responses in two Chinese cabbage geno‐ types with contrasting drought tolerance under mild and severe drought by widely tar‐ geted metabolome technology. This study aimed to (i) identify drought−responsive me‐ tabolites and potential drought stress biomarkers in Chinese cabbage; (ii) compare the  metabolic responses of Chinese cabbage genotypes with contrasting drought tolerance  under mild and severe drought; and (iii) explore potential metabolites associated with  increased drought tolerance and propose a metabolic response framework in Chinese cab‐ bage under drought stress.  2. Results  2.1. Screening for Drought Tolerant and Susceptible Genotypes of Chinese Cabbage  The seed germination rate of 27 Chinese cabbage inbred lines was observed under  20% polyethylene glycol (PEG−6000) and two lines with extreme phenotypic variations  were identified, with 14S837 having the highest germination rate (~80%) while 88S148  having no seed germination (Figure S1). These two lines were selected as candidates rep‐ resenting drought−tolerant (DT) and drought−susceptible (DS) genotypes, respectively.  The phenotypes of the candidate lines were further studied and validated at the seed‐ ling stage under mild and severe drought conditions. Drought stress intensity was deter‐ mined by monitoring soil water content (SWC), and mild drought (50~55% SWC) and se‐ vere drought (30~35% SWC) were achieved after 3 days and 5 days without watering, in  our controlled growth chamber, respectively (Figure 1a). We found that these two lines  had no visible phenotypic alterations when exposed to mild drought, though the leaf wa‐ ter content of 88S148 decreased significantly compared with that of the control plants.  Under severe drought conditions, no visible phenotypic changes were observed in 14S837,  but leaf water content began to decrease. In direct contrast, 88S148 showed severe wilting  symptoms and a lower leaf water content (Figure 1b,c). Additionally, the water loss in  detached shoots was measured, and the data showed that the shoots of 14S837 lost water  more slowly than 88S148 (Figure 1d). With the above data from studying seed and seed‐ ling phenotypes under drought stress conditions, 14S837 and 88S148 were selected as DT  and DS genotypes of Chinese cabbage, respectively, for subsequent metabolomics studies.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  3  of  18  Figure 1. Phenotypic screening and investigations of drought−susceptible (DS) and drought−toler‐ ant (DT) genotypes. (a) Soil water content during drought stress. Sampling time labeled in red; (b)  Morphology of DS and DT after 3 and 5 days without watering. Scale bars, 7 cm; (c) Leaf water  content of DS and DT after 3 and 5 days without watering. Statistical differences are indicated with  lowercase letters determined by Duncan’s test at P < 0.05. (d) Water loss of DS and DT. All data are  shown as means ± SE with three independent biological replicates.  2.2. Metabolome Profiling  To investigate the metabolic response to drought stress in Chinese cabbage, leaf sam‐ ples of DS and DT were collected from day 3 and day 5 drought−treatment plants along‐ side the controls, and total plant metabolites were extracted and analyzed using a widely  targeted  metabolome  analysis  based  on  an  ultra−performance  liquid  chromatog‐ raphy−tandem mass spectrometry (UPLC−MS/MS) platform. A total of 777 metabolites  were detected in all 24 samples in our drought assay, and they could be further divided  into 14 classes, including 147 phenolic acids, 140 lipids, 94 flavonoids, 86 amino acids and    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  4  of  18  derivatives, 75 alkaloids, 61 organic acids, 50 nucleotides and derivatives, 34 saccharides  and alcohols, 28 lignans and coumarins, 18 vitamins, 12 glucosinolates, eight terpenoids,  two quinones, and 22 other metabolites (Figure 2a, TableS1). A total of 371 metabolites  were annotated using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) compound  database, and 252 metabolites were further mapped to plant metabolic pathways using  the KEGG pathway database.  The total ion current (TIC) of different quality control (QC) samples showed highly  overlapping patterns in retention time and peak intensity, confirming the data was stable  and repeatable at the tested time points (Figure S2). Principal component analysis (PCA)  was carried out to visualize the overall metabolic differences and relationship among sam‐ ples. The PCA of all samples (including QC samples) showed little variation within each  group, but large variation between groups (Figure 2b). The two major components of PCA  explained 47.4% of the total variance, and the first principal component (PC1) explained  29.72% of the total variation, thus separating the two contrasting groups of DS and DT  unambiguously. Separation between the drought treatment and control groups indicated  drought treatment significantly affected the metabolism of the two lines, suggesting our  methodology correctly reveals the metabolic basis of drought stress. A heatmap based on  Pearson’s correlation coefficient between all samples (including QC samples) was also  constructed  (Figure  2c),  showing  a  highly  significant  positive  correlation  among  three  tested biological replicates. On the whole, our experimental design and data are solid and  well suited for downstream analysis.   Figure 2. Metabolic profiling of drought−tolerant and susceptible genotypes in response to mild and  severe drought stress. (a) Number of metabolites and differential metabolites in different classes.  The statistical significance was determined via hypergeometric test with * P < 0.05; (b) Principal    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  5  of  18  component analysis (PCA); (c) Heatmap of Pearson’s correlation coefficient. Different colors repre‐ sent different samples, DS−3d (pink), DS−3d−CK (baby blue), DS−5d(orange), DS−5d−CK (green),  DT−3d (purple), DT−3d−CK (dark blue), DT−5d (lightsalmon), DT−5d−CK (dark green), mix (golden  yellow).  2.3. Differential Metabolites in Multiple Comparison Groups  To identify differential metabolites (DMs), orthogonal partial least squares discrimi‐ nant  analysis  (OPLS−DA)  was  performed  in  12  comparison  groups  and  variable  im‐ portance in projection (VIP) values were obtained. DMs were determined by fold changes  (FC) ≥1.5 or ≤0.67 and VIP ≥ 1, and a total of 597 DMs were identified in all tested compar‐ ison groups, providing the core DMs data for subsequent analysis (Figure 3a, Table S2).   In  order  to  understand  the  dynamics  of  DMs  in  different  comparison  groups,  K−means cluster analysis was performed based on the accumulation patterns of different  metabolites, and six sub−classes were identified (Figure 3b, Table S3). A total of 137, 73,  92, 96, 66, and 133 metabolites were clustered from sub−classes 1 to 6, respectively. Nota‐ bly, DMs in sub−class 4 and 5 show higher accumulation under severe drought conditions,  suggesting  that these  metabolites  might  be  top  metabolic  candidate  biomarkers  in the  drought response of Chinese cabbage.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  6  of  18  Figure 3. Analysis of differential metabolites (DMs). (a) Number of upregulated and downregulated  DMs in 12 comparison groups; (b) The K−means analysis of DMs.  2.4. Exploration of Key Drought−Responsive Metabolites in Chinese Cabbage  To explore the metabolic response of Chinese cabbage under drought stress, we first  examined  the  variation  of  DMs  in  four  comparison  groups  (DS−3d−CK  vs.  DS−3d,  DS−5d−CK vs. DS−5d, DT−3d−CK vs. DT−3d, DT−5d−CK vs. DT−5d), and a total of 291  DMs were detected in the above four comparison groups (Table S2). Among the 291 me‐ tabolites, 27.89% (41/147) phenolic acids, 30% (42/140) lipids, 15.96% (15/94) flavonoids,  65.12% (56/86) amino acids and derivatives, 50.67% (38/75) alkaloids, 50.82% (31/61) or‐ ganic acids, 72% (36/50) nucleotides and derivatives, 41.18% (14/34) saccharides and alco‐ hols, 21.43% (6/28) lignans and coumarins, 27.78% (5/18) vitamin, 41.67% (5/12) glucosin‐ olates, and 9.09% (2/22) other metabolites, they showed differential accumulation patterns  in response to drought stress (Figure 2a). Notably, amino acids and derivatives, alkaloids,  organic  acids,  and  nucleotides  and  derivatives,  were  significantly  affected  by  drought  stress. KEGG pathway enrichment analysis indicated that DMs responding to drought    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  7  of  18  stress were significantly enriched in 13 pathways including purine metabolism, 2−oxocar‐ boxylic acid metabolism, metabolic pathways, glyoxylate and dicarboxylate metabolism,  biosynthesis of amino acids, aminoacyl−tRNA biosynthesis, lysine biosynthesis, carbon  metabolism, ABC transporters, lysine degradation, the citrate cycle (TCA cycle), arginine  biosynthesis, and tryptophan metabolism (Figure 4).  Figure 4. KEGG pathway analysis of 291 differential metabolites of drought−tolerant and suscepti‐ ble genotypes in response to drought stress.  Venn diagrams were constructed to show the number of common DMs in both lines  under mild drought and severe drought stress conditions. Five common upregulated and  five common downregulated DMs were found in DS and DT under mild drought, while  55 common DMs were upregulated and 14 common DMs were downregulated in both DS  and DT under severe drought (Figure 5a,b). Four common DMs in both genotypes and  drought conditions, abscisic acid (ABA), serine, choline alfoscerate (GPC), and sphingo‐ sine, were proposed as potential biomarkers of drought stress in Chinese cabbage. Fur‐ thermore, 28 common upregulated and eight common downregulated DMs were specifi‐ cally  altered  in  DS−3d  vs.  DS−5d  and  DT−3d  vs.  DT−5d  but  not  in  DS−3d−CK  vs.  DS−5d−CK and DT−3d−CK vs. DT−5d−CK (Figure 5c,d, Table S2). These common DMs    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  8  of  18  with similar response patterns to drought stress in both genotypes were considered to be  the drought−responsive metabolites. By removing the duplicated metabolites, a total of 90  metabolites,  with  68  upregulated  and  22  downregulated  ones,  were  selected  and  pro‐ posed  as  the  drought−responsive  metabolites  in  Chinese  cabbage  (Figure  6,  Table  S4).  Among these drought−responsive metabolites, 24 metabolites were classified as amino  acids and derivatives. Thus, we further investigated the levels of free amino acids under  drought stress. Serine levels were increased in both drought treatments and genotypes.  Proline, leucine, isoleucine, methionine, and tyrosine showed a similar response pattern  with higher accumulation under severe drought treatment in both genotypes. The aspartic  acid levels were higher in DT irrelevant of drought treatment and were specifically de‐ creased in DT upon severe drought. Other amino acids, including threonine, asparagine,  cysteine and glutamic acid, were found to be unaffected by drought stress.   Figure 5. Venn diagrams showing the numbers of upregulated (a,c) and downregulated (b,d) dif‐ ferential metabolites (DMs) in different comparison groups. The metabolites labeled in red are con‐ sidered as the drought−responsive metabolites.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  9  of  18  Figure 6. Heatmap of 90 drought−responsive metabolites in Chinese cabbage was constructed based  on  Log2  ratios  of  fold  changes.  The  metabolites  labeled  in  red  were  considered  as  potential  bi‐ omarkers of drought stress in Chinese cabbage. The Log2 (fold changes values) and the color scale  are shown at the bottom right of heatmap.  In conclusion, we identified a large number of metabolites involved in the drought  responses of Chinese cabbage, among which, amino acids and derivatives played more  important roles in the drought responses.  2.5. Differential Drought Responses between DS and DT Genotypes  In order to study the differential response of DS and DT to drought stress, KEGG  pathway enrichment analysis was performed for DMs in four comparison groups (Figure  7). 59 DMs (36 upregulated and 23 downregulated) were found in DS−3d−CK vs. DS−3d,  which were enriched in glycerophospholipid metabolism, sphingolipid metabolism, and  plant hormone signal transduction, whereas 98 DMs (39 upregulated and 59 downregu‐ lated) were found in DT−3d−CK vs. DT−3d enriched in carbon metabolism, carbon fixa‐ tion in photosynthetic organisms, glyoxylate and dicarboxylate metabolism, glycerolipid  metabolism, starch and sucrose metabolism, biosynthesis of secondary metabolites, met‐ abolic pathways, galactose metabolism, and the TCA cycle (Figures 3a and 7a,b). In the  mild drought stress, there were more DMs in DT, especially more downregulated DMs,  indicating that mild drought stress had a stronger effect on DT.   Under 5−day drought treatment, there were 151 DMs (111 upregulated and 40 down‐ regulated) in DS, which mainly involved in aminoacyl−tRNA biosynthesis, glucosinolate  biosynthesis, glycerophospholipid metabolism, biosynthesis of amino acids, tropane, pi‐ peridine, pyridine alkaloid biosynthesis, ABC transporters, metabolic pathways, lysine  degradation, and 2−oxocarboxylic acid metabolism. In comparison, 165 DMs (111 upreg‐ ulated and 54 downregulated) were identified in DT, enriched in purine metabolism, TCA    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  10  of  18  cycle, metabolic pathways, carbon metabolism, pyruvate metabolism, carbon fixation in  photosynthetic organisms, 2−oxocarboxylic acid metabolism, and glyoxylate and dicar‐ boxylate  metabolism  (Figures  3a  and  7c,d).  Notably,  the  differential  abundance  (DA)  scores of DT were mostly negative in the enrichment pathways under mild drought and  severe drought conditions (Figure 7b,d), while the scores in DS were mostly positive in  the enrichment pathways (Figure 7a,c).  Figure 7. KEGG pathway enrichment analysis and differential abundance (DA) scores of differential  metabolites (DMs) in four comparison groups. (a) DS−3d−CK vs. DS−3d; (b) DT−3d−CK vs. DT−3d;  (c) DS−5d−CK vs. DS−5d; (d) DT−5d−CK vs. DT−5d.  To further explore the different metabolic response patterns of the two selected con‐ trasting Chinese cabbage genotypes, a comparative metabolic analysis between DS and  DT was performed (Figure 8, Table S2). Fifty−nine metabolites accumulated more in DT,  especially some of the key drought−responsive metabolites, such as ABA, GPC, and re‐ duced glutathione, which may explain the increased drought tolerance observed in DT  (Figure 8a). Furthermore, 84 common DMs showed higher accumulation in DS in both  drought and control conditions compared with the ones in DT, including 25 phenolic ac‐ ids and 25 flavonoids, thus indicating DS contains more phenolic acids and flavonoids  (Figure 8b).    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  11  of  18  Figure 8. Venn diagram showing the number of upregulated (a) and downregulated (b) differential  metabolites (DMs) between DS and DT under control and drought conditions.  3. Discussion  As sessile organisms, plants need to respond to the great challenges of environmental  stresses, among which, drought is one of the most severe ones, especially in the large arid  and  semi−arid  areas  located  primarily  in  the  developing  countries  and  regions  of  the  world [2]. Understanding  the  plants’ drought  responses  can  not  only  help  our  under‐ standing of how different plant species mitigate drought stresses, but also provide in‐ sights to crop breeding for high water use efficiency and for crop security within econom‐ ically vulnerable populations. Metabolites are the key tools for plants to facilitate water  use, especially in leafy vegetables like Chinese cabbage, which require large quantities of  water but have a limited ability to extract water from soil. In this current study, we ana‐ lyzed the metabolome of two Chinese cabbage genotypes with different drought tolerance  abilities and found that amino acids and derivatives, alkaloids, organic acids, and nucle‐ otides and derivatives in Chinese cabbage were significantly affected by drought stress.  A total of 777 metabolites were detected by a widely targeted metabolome and 90 metab‐ olites were selected and proposed as the drought−responsive metabolites in Chinese cab‐ bage, with ABA, serine, choline alfoscerate, and sphingosine as potential representative  drought stress biomarkers. In addition, we also found that DS and DT have different me‐ tabolite response patterns and contrasting coping strategies in response to drought stress,  which might explain their corresponding phenotypic differences under drought stress.  Notably,  constitutively  high  levels  of  ABA  and  glutathione  were  detected  in  the  drought−tolerant genotype in all tested and control conditions, which might help explain  the increased drought tolerance of DT. A simplified drought response model in Chinese  cabbage was proposed according to our study.  The plant hormone ABA plays a central role in response to abiotic stress by modu‐ lating stomata, plant growth, and metabolic pathways [15,16]. In our study, ABA was  shown to be the most important metabolite in Chinese cabbage for responding to drought  stress. We found that the level of ABA increased rapidly under drought stress in both  genotypes. More importantly, the level of ABA in DT was higher than the one in DS under  both drought and control conditions. Thus, the differential levels of ABA may explain the  contrasting phenotypic differences observed, though the mechanism of ABA accumula‐ tion in DT requires further investigation.  Some important intermediates in the TCA cycle, including citric acid, isocitric acid,  α−ketoglutaric acid, succinic acid, and malic acid, were shown to have a lower accumula‐ tion in DT under drought stress, indicating that the TCA cycle was inhibited by water  deficiency. This is consistent with downregulation of enriched metabolic pathways in DT  and may be related to the drought acclimation ability of DT. Furthermore, it has been  shown that citric acid can confer abiotic stress tolerance in plants, and exogenous citric    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  12  of  18  acid application can also enhance drought tolerance in a variety of plant species [17–20].  Therefore, increasing endogenous citric acid level by exogenous spray may be a poten‐ tially useful approach for improving the drought tolerance of Chinese cabbage.  Proline has been reported in multiple studies as another important drought−respon‐ sive metabolite [13,21–23]. Beyond acting as an osmolyte for osmotic adjustment, proline  also stabilizes sub−cellular structures and contributes to reactive oxygen species (ROS)  detoxification [24]. Although we did not observe changes in proline levels under mild  drought stress, the concentration increased under severe drought condition in both geno‐ types. Serine, which is required for cysteine and methionine biosynthesis, was proposed  as one of the potential biomarkers of drought stress in Chinese cabbage. Methionine, the  precursor of aliphatic glucosinolates, showed increased levels under severe drought con‐ dition in both DS and DT, which may explain why the aliphatic glucosinolates increased  under drought stress. Aspartic acid can be transformed from oxaloacetate, an intermedi‐ ate in the TCA cycle that can be catalyzed by aspartate aminotransferase [25]. Thus, the  decreased levels of aspartic acid in DT may be a result of downregulation of other inter‐ mediates in the TCA cycle.  Glutathione (GSH) is a non−protein tripeptide involved in the detoxification of excess  ROS, maintaining cellular redox homeostasis and regulating protein function in plants  under abiotic and biotic stresses [26–28]. Reduced GSH is oxidized to disulfide (GSSG)  during ROS scavenging, and GSSG is recycled to GSH by glutathione reductase [24]. Pre‐ vious studies have shown that the levels of GSH increase in response to drought stress  [29]. Furthermore, exogenously applied and endogenously increased GSH can improve  drought stress tolerance in many plant species [27,30–32]. While we found no significant  changes in the content of GSH in our drought assay, the plants accumulated more GSH in  the severe drought stress condition. Moreover, the level of GSH was higher in DT inde‐ pendent of the stress, which may be related to its increased drought tolerance. Further‐ more, S−(methyl) glutathione, the thioether of glutathione [33], was induced by drought  stress, and its role in the drought response of Chinese cabbage warrants further investi‐ gation.  Soluble sugars mainly include sucrose and its products glucose and fructose [34]. It  was found that drought increased the amount of soluble sugar in Chinese cabbage [35].  In this study, we discovered that drought stress increased sucrose levels in Chinese cab‐ bage but did not significantly affect the levels of glucose and fructose, which suggests that  sucrose plays important roles in osmotic adaption under drought stress.  Phenolic acids, a major class of polyphenols, are constitutively present in vegetables  with strong antioxidant activity [36,37]. Drought stress enhanced the accumulation of phe‐ nolic acids [29,38]. In this study, we identified a total of 147 phenolic acids, and nine phe‐ nolic acids were considered to be involved in the response to drought stress of Chinese  cabbage, including 4−methylphenol, 2−hydroxy−3−phenylpropanoic acid, 3−(4−hydroxy‐ phenyl)−propionic  acid,  p−coumaric  acid  methyl  ester,  methyl  sinapate,  sin‐ apoyl−4−O−glucoside,  curculigine,  sinapoylsinapoyltartaric  acid,  and  1−O−caffeoyl−(6−O−glucosyl)−β−D−glucose. Interestingly, we found that nearly half of the  39 upregulated metabolites in the DT−3d−CK vs. DT−3d comparison group were phenolic  acids, which may improve the drought tolerance of DT by increasing antioxidant activity  in the early stages of drought stress (Table S2).  Pipecolic acid is a lysine−derived non−protein amino acid which regulates plant sys‐ temic acquired resistance and basal immunity to bacterial pathogen infection [39]. Recent  study has shown that pipecolic acid plays a negative regulatory role in drought tolerance  of tomato plants [40]. In this study, the level of DL−pipecolic acid in DT decreased under  mild drought stress, which may be related to the drought resistance response in DT.   Quinic acid is a cyclic carboxylic acid involved in the shikimate pathway [41]. It was  reported that quinic acid is the main contributor to the osmotic potential of Quercus suber  leaves [42], and its concentration increased under drought stress in some species [23,43].  However, the level of quinic acid decreased in both genotypes under mild drought and    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  13  of  18  further decreased with the aggravation of drought in DT. This result was in accordance  with a report on broccoli [22], Salvia miltiorrhiza Bunge (Danshen) [44], peach [45] and  maize [46]. Especially in broccoli, low levels of quinic acid were considered to be an im‐ portant signature of drought tolerance [22]. Consequently, the effect of quinic acid in re‐ sponse to drought needs to be further studied.  γ−aminobutyric acid (GABA), a non−protein amino acid, functions as an intrinsic sig‐ naling molecule and accumulates quickly in response to a variety of abiotic stresses in  plants [47–49]. Research has suggested that GABA can reduce stomatal opening and tran‐ spiration water loss by negatively regulating the activity of a stomatal guard cell tono‐ plast−localized  anion  transporter  ALMT9,  thus  improving  water  use  efficiency  and  drought tolerance [50]. Exogenous GABA application can increase drought tolerance in  many plant species, e.g., white clover [51], creeping bentgrass [52], and snap bean [53].  However, little is known about the roles of GABA in Chinese cabbage. To our knowledge,  this study is the first to report that drought stress can induce GABA accumulation in Chi‐ nese cabbage. In parallel with previous research, the roles and mechanisms of GABA in  the drought response of Chinese cabbage must be further studied.  Based on our findings, we propose a simplified model on how the drought−tolerant  genotype of Chinese cabbage responds to mild and severe stresses at the metabolic level  (Figure 9).  Figure 9. The outline of drought−tolerant genotype responses to drought stress. The red represents  increased, while the green represents decreased. ABA, abscisic acid; IAA, indole 3−acetic acid; GPC,  choline alfoscerate; TCA cycle, citrate cycle; GABA, γ−aminobutyric acid; ROS, reactive oxygen spe‐ cies.  4. Materials and Methods  4.1. Plant Materials and PEG Treatment  The seeds of 27 Chinese cabbage inbred lines, including 88S148 and 14S837, were  provided  by  the  Chinese  cabbage  research  group,  College  of  Horticulture,  Northwest  A&F University, Yangling, China.  The  drought  assay  was  conducted  by  screening  seed  germination  under  20%  PEG6000−induced osmotic stress. In brief, 30 seeds of the same size, that were full and  disease−free were picked and disinfected with 75% ethanol for 1 min, followed by 10%  sodium hypochlorite solution (NaClO) for 15 min, then rinsed repeatedly with sterilized  water. Next, the disinfected seeds were spread in a 9 cm diameter petri dish containing  three filter papers as the germination bed, and soaked with 10 mL 20% PEG6000 (10 mL  sterile water as the control), and germinated in a 25 °C light incubator (Dongnan Instru‐ ment Co., Ltd. Ningbo, China). A 1 mL PEG solution per day (sterile water for control)  was supplemented to each dish during germination. The germination rate was counted    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  14  of  18  on the seventh day and three independent biological replicates were performed. All rea‐ gents are purchased from Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China).  4.2. Growth Conditions and Drought Treatment  The seeds were sown in 7 cm pots containing a soil matrix of equal weight. Seedlings  were grown in the light incubator (Dongnan Instrument Co., Ltd. Ningbo, China) at 25 °C  −2 −1  with 14 h light (150 μmol m s of light intensity)/10 h dark cycles and watered normally.  Drought  treatment  was  simulated  by  a  water  deficit.  Briefly,  the  seedlings  were  grown under the conditions described above. The 3−week−old seedlings were watered  until the soil was saturated and did not contain much water. Subsequently, the seedlings  undergoing drought treatment were no longer watered after removing excess water from  the tray.  4.3. Water Loss, Soil Water Content and Leaf Water Content Measurement  Water loss was measured according to a previous method [54]. Briefly, the detached  shoots of 3−week−old seedlings were immediately weighed and recorded eight times at  one−hour intervals. Water loss was expressed as the percentage of initial fresh weight.  Three replicates were performed and each replicate contained six individual plants.  Soil water content was determined by the oven drying method. In brief, the fresh  weight of the soil matrix in the pot was weighed after removing the roots, then the soil  was oven dried at 105 °C for 12 h and weighed again. The soil water content was expressed  by the percentage of weight lost out of the initial fresh weight and recorded at 24 h inter‐ vals. Three replicates were performed and each replicate contained three individual sam‐ ples.  For the measurement of leaf water content, the second leaves were collected and im‐ mediately weighed to obtain the fresh weight (FW), then the leaves were oven dried at 80  °C for 24 h and dry weights (DW) were measured. Leaf water content (%) was calculated  as [(FW − DW)/FW] × 100. Three replicates were performed and each replicate contained  three individual plants.  4.4. Sample Collection  The seedlings of drought−tolerant and susceptible genotypes were grown in a light  incubator with the conditions described above. The second intact leaves counted from  outside to inside were collected from five individual plants when the soil water content  reached 50~55% (drought for 3 d) and 30~35% (drought for 5 d), respectively. The plants  with normal irrigation were also sampled as controls (CK) at the same time. Therefore, a  total  of  four  group  samples  were  collected,  designated  as  DS−3d/DS−3d−CK,  DS−5d/DS−5d−CK, DT−3d/DT−3d−CK, DT−5d/DT−5d−CK, and three independent biolog‐ ical replicates were performed. The collected leaves were snap−frozen in liquid nitrogen  immediately and stored at −80 °C until extraction.   4.5. Metabolome Profiling  Widely targeted metabolome was employed to acquire the metabolomic profile of  samples conducted by Wuhan Metware Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, China). In brief,  the sample leaves were freeze−dried by a vacuum freeze−dryer (Scientz−100F, Ningbo,  China) and crushed using a mixer mill (MM 400, Retsch, Germany) at 30 Hz for 90 s. Ly‐ ophilized powder (100 mg) was weighed and dissolved with 1.2 mL 70% methanol solu‐ tion (vortex 30 s every 30 min and repeated six times), followed by overnight extraction  at 4 °C. Finally, the extract was centrifuged at 12,000 rpm for 10 min, and the supernatant  was collected and filtered through a filter membrane (0.22 μm pore size, ANPEL, Shang‐ hai, China) before UPLC−MS/MS analysis.  The sample extracts were analyzed using an UPLC−ESI−MS/MS system (UPLC, SHI‐ MADZU Nexera X2, Kyoto, Japan; MS, Applied Biosystems 4500 Q TRAP, Waltham, MA,    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  15  of  18  USA). Quality control samples (QC) prepared by mixing all sample extracts were inserted  every 10 samples to monitor the repeatability of the analysis process. UPLC separation  was performed with the same protocol as Yuan et al. [55]. Mass spectrographic analysis  was performed by a triple quadrupole–linear ion trap mass spectrometer equipped with  an ESI Turbo Ion−Spray interface (Applied Biosystems 4500 Q TRAP UPLC/MS/MS Sys‐ tem), which operated according to a previous study [56]. The mass spectrometry data was  processed with the Analyst 1.6.3 software (AB Sciex). Qualitative analysis of metabolites  was identified based on MetWare database (Wuhan Metware Biotechnology Co.,  Ltd.,  Wuhan, China) and other public databases. Quantification of metabolites was carried out  using multiple reaction monitoring method [56].  4.6. Data Analysis  Identified  metabolites  were  annotated  using  the  KEGG  compound  database  (http://www.kegg.jp/kegg/compound/, accessed on 15  November 2021); annotated me‐ tabolites  were  then  mapped  to  the  KEGG  pathway  database  (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html,  accessed  on  15  November  2021)  [57].  KEGG  pathway enrichment analysis was performed using the Metware Cloud, a free online plat‐ form for data analysis (https://cloud.metware.cn, accessed on 10 January 2022) and signif‐ icance was determined by hypergeometric test. The differential abundance (DA) score is  a metabolic change analysis method based on a pathway which can reflect the overall  changes of all differential metabolites in a pathway. DA score is calculated as (number of  upregulated DMs annotated to a pathway−number of downregulated DMs annotated to  the pathway)/number of all metabolites annotated to the pathway.  Multivariate statistical analysis can simplify the high−dimensional and complex data,  and retain the original information to the greatest extent. PCA, a classic unsupervised pat‐ tern recognition multivariate statistical analysis method, was performed by the prcomp  function within R (www.r‐project.org, accessed on 15 November 2021). The data was unit  variance scaled before PCA. OPLS−DA, a supervised pattern recognition method, was  performed by R software using R package MetaboAnalystR [58]. The data was log trans‐ formed (log2) and mean centered before OPLS−DA. In order to avoid overfitting, a per‐ mutation  test  (200  permutations)  was  performed.  VIP  values  were  extracted  from  the  OPLS−DA result to identify DMs.  Pearson correlation coefficients (PCC) and K−means cluster analysis were also per‐ formed with the Metware Cloud. For the K−Means analysis, the relative contents of DMs  in all groups were standardized using the Z−score algorithm. A heatmap of metabolites  was displayed by TBtools [59].  Supplementary  Materials:  The  following  supporting  information  can  be  downloaded  at:  www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23115947/s1.  Author Contributions: Conceptualization, L.C. and B.L.; methodology, L.C. and B.L.; validation,  W.Y., Q.P., Q.Z. and Q.S.; formal analysis, L.C.; investigation, L.C., Y.S. and C.L.; resources, B.L. and  L.Z.; writing−original draft, L.C.; writing−review and editing, B.L. and L.Z.; funding acquisition,  B.L. and L.Z. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.  Funding: This research was funded by the Key Research and Development Program of Yangling  Seed  Innovative  Center  (Ylzy‐sc‐04)  to  L.Z.,  National  Natural  Science  Foundation  of  China  (32070333) to B. L., and Startup Funding (Z111021922) from Northwest A&F University to B.L.  Institutional Review Board Statement: Not applicable.  Informed Consent Statement: Not applicable.  Data Availability Statement: Not applicable.  Acknowledgments: We thank Albert Liu (University of California, Berkeley) for English editing on  the manuscript. We also thank Wuhan Metware Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, China) for provid‐ ing technical support.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  16  of  18  Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.  References  1. Zhu, J.K. Abiotic Stress Signaling and Responses in Plants. Cell 2016, 167, 313–324.  2. Knapp, J. Water use in arid and semi‐arid regions: In the hands of local and watershed‐level managers. J. Soil Water Conserv.  1995, 50, 412–423.  3. Wang, J.Y.; Li, C.N.; Li, L.; Reynolds, M.; Mao, X.G.; Jing, R.L. Exploitation of Drought Tolerance‐Related Genes for Crop Im‐ provement. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10265.  4. Park, B.J.; Liu, Z.C.; Kanno, A.; Kameya, T. Genetic improvement of Chinese cabbage for salt and drought tolerance by consti‐ tutive expression of a B. napus LEA gene. Plant Sci. 2005, 169, 553–558.  5. Zhuang, J.; Zhang, J.; Hou, X.; Wang, F.; Xiong, A.‐S. Transcriptomic, Proteomic, Metabolomic and Functional Genomic Ap‐ proaches for the Study of Abiotic Stress in Vegetable Crops. Crit. Rev. Plant Sci. 2014, 33, 225–237.  6. Tian, H.; Lam, S.M.; Shui, G. Metabolomics, a Powerful Tool for Agricultural Research. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1871.  7. Guo, Y.M.; Samans, B.; Chen, S.; Kibret, K.B.; Hatzig, S.; Turner, N.C.; Nelson, M.N.; Cowling, W.A.; Snowdon, R.J. Drought‐ Tolerant Brassica rapa Shows Rapid Expression of Gene Networks for General Stress Responses and Programmed Cell Death  Under Simulated Drought Stress. Plant Mol. Biol. Report. 2017, 35, 416–430.  8. Yu, S.; Zhang, F.; Yu, Y.; Zhang, D.; Zhao, X.; Wang, W. Transcriptome Profiling of Dehydration Stress in the Chinese Cabbage  (Brassica rapa L. ssp. pekinensis) by Tag Sequencing. Plant Mol. Biol. Report. 2012, 30, 17–28.  9. Eom, S.H.; Baek, S.‐A.; Kim, J.K.; Hyun, T.K. Transcriptome Analysis in Chinese Cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) Provides  the Role of Glucosinolate Metabolism in Response to Drought Stress. Molecules 2018, 23, 1186.  10. Zhao, M.; Ren, Y.; Wei, W.; Yang, J.; Zhong, Q.; Li, Z. Metabolite Analysis of Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus L.) Seed‐ lings in Response to Polyethylene Glycol‐Simulated Drought Stress. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3294.  11. Fadoul, H.E.; Martínez Rivas, F.J.; Neumann, K.; Balazadeh, S.; Fernie, A.R.; Alseekh, S. Comparative Molecular and Metabolic  Profiling of Two Contrasting Wheat Cultivars under Drought Stress. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 13287.  12. Lawas, L.M.F.; Li, X.; Erban, A.; Kopka, J.; Jagadish, S.V.K.; Zuther, E.; Hincha, D.K. Metabolic responses of rice cultivars with  different tolerance to combined drought and heat stress under field conditions. GigaScience 2019, 8, 1–21.  13. You, J.; Zhang, Y.J.; Liu, A.L.; Li, D.H.; Wang, X.; Dossa, K.; Zhou, R.; Yu, J.Y.; Zhang, Y.X.; Wang, L.H.; et al. Transcriptomic and  ‐tolerant and susceptible sesame genotypes in response to drought stress. BMC Plant Biol.  metabolomic profiling of drought 2019, 19, 267.  14. Shawon, R.A.; Kang, B.S.; Lee, S.G.; Kim, S.K.; Lee, H.J.; Katrich, E.; Gorinstein, S.; Ku, Y.G.; Influence of drought stress on  bioactive compounds, antioxidant enzymes and glucosinolate contents of Chinese cabbage (Brassica rapa). Food Chem. 2020, 308,  125657.  15. Zhang, J.H.; Jia, W.S.; Yang, J.C.; Ismail, A.M.; Role of ABA in integrating plant responses to drought and salt stresses. Field  Crops Res. 2006, 97, 111–119.  16. Hsu, P.‐K.; Dubeaux, G.; Takahashi, Y.; Schroeder, J.I.; Signaling mechanisms in abscisic acid‐mediated stomatal closure. Plant  J. 2021, 105, 307–321.  17. Tahjib‐Ul‐Arif, M.; Zahan, M.I.; Karim, M.M.; Imran, S.; Hunter, C.T.; Islam, M.S.; Mia, M.A.; Hannan, M.A.; Rhaman, M.S.;  Hossain, M.A.; et al. Citric Acid‐Mediated Abiotic Stress Tolerance in Plants. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7235.  18. Xie, H.; Bai, G.; Lu, P.; Li, H.; Fei, M.; Xiao, B.G.; Chen, X.J.; Tong, Z.J.; Wang, Z.Y.; Yang, D.H. Exogenous citric acid enhances  drought tolerance in tobacco (Nicotiana tabacum). Plant Biol. 2022, 24, 333–343.  19. El‐Tohamy, W.A.; El‐Abagy, H.M.; Badr, M.A.; Gruda, N. Drought tolerance and water status of bean plants (Phaseolus vulgaris  L.) as affected by citric acid application. J. Appl. Bot. Food Qual. 2013, 86, 212–216.  20. Darandeh, N.; Hadavi, E. Effect of pre‐harvest foliar application of citric acid and nnalic acid on chlorophyll content and post‐ harvest vase life of Lilium cv. Brunello. Front. Plant Sci. 2012, 2, 106.  21. Guo, Q.; Li, X.; Li, N.; Jameson, P.E.; Zhou, W. Transcription‐associated metabolomic adjustments in maize occur during com‐ bined drought and cold stress. Plant Physiol. 2021, 186, 677–695.  22. Chevilly, S.; Dolz‐Edo, L.; Lopez‐Nicolas, J.M.; Morcillo, L.; Vilagrosa, A.; Yenush, L.; Mulet, J.M. Physiological and Molecular  Characterization of the Differential Response of Broccoli (Brassica oleracea var. Italica) Cultivars Reveals Limiting Factors for  Broccoli Tolerance to Drought Stress. J. Agric. Food Chem. 2021, 69, 10394–10404.  23. Wan, T.; Feng, Y.; Liang, C.; Pan, L.; He, L.; Cai, Y. Metabolomics and Transcriptomics Analyses of Two Contrasting Cherry  Rootstocks in Response to Drought Stress. Biology 2021, 10, 201.  24. Hayat, S.; Hayat, Q.; Alyemeni, M.N.; Wani, A.S.; Pichtel, J.; Ahmad, A. Role of proline under changing environments: A review.  Plant Signal. Behav. 2012, 7, 1456–1466.  25. Kirsch, J.F.; Eichele, G.; Ford, G.C.; Vincent, M.G.; Jansonius, J.N.; Gehring, H.; Christen, P. Mechanism of action of aspartate  aminotransferase proposed on the basis of its spatial structure. J. Mol. Biol. 1984, 174, 497–525.  26. Koramutla, M.K.; Negi, M.; Ayele, B.T. Roles of Glutathione in Mediating Abscisic Acid Signaling and Its Regulation of Seed  Dormancy and Drought Tolerance. Genes 2021, 12, 1620.  27. Cheng, M.C.; Ko, K.; Chang, W.L.; Kuo, W.C.; Chen, G.H.; Lin, T.P. Increased glutathione contributes to stress tolerance and  global translational changes in Arabidopsis. Plant J. Cell Mol. Biol. 2015, 83, 926–939.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  17  of  18  28. Noctor, G.; Mhamdi, A.; Chaouch, S.; Han, Y.; Neukermans, J.; Marquez‐Garcia, B.; Queval, G.; Foyer, C.H. Glutathione in plants:  An integrated overview. Plant Cell Environ. 2012, 35, 454–484.  29. Sarker, U.; Oba, S. Drought stress enhances nutritional and bioactive compounds, phenolic acids and antioxidant capacity of  Amaranthus leafy vegetable. BMC Plant Biol. 2018, 18, 1–15.  30. Chen, J.H.; Jiang, H.W.; Hsieh, E.J.; Chen, H.Y.; Chien, C.T.; Hsieh, H.L.; Lin, T.P. Drought and salt stress tolerance of an Ara‐ bidopsis glutathione S‐transferase U17 knockout mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.  Plant Physiol. 2012, 158, 340–351.  31. Raja, V.; Wani, U.M.; Wani, Z.A.; Jan, N.; Kottakota, C.; Reddy, M.K.; Kaul, T.; John, R. Pyramiding ascorbate‐glutathione path‐ way in Lycopersicum esculentum confers tolerance to drought and salinity stress. Plant Cell Rep. 2021, 41, 619–637.  Jia, S.; Yu, D.; Wei, T.; Chen, C.; Song, W. Overexpression of the Glutathione Peroxidase 5 (RcGPX5)  32. Zhang, L.; Wu, M.; Teng, Y.;  Gene from Rhodiola crenulata Increases Drought Tolerance in Salvia miltiorrhiza. Front. Plant Sci. 2019, 9, 1950.  33. Terwilliger, T.C.; Bollag, G.E.; Sternberg, D.W., Jr.; Koshland, D. S‐methyl glutathione synthesis is catalyzed by the cheR me‐ thyltransferase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1986, 165, 958–963.  34. Jiang, M.; Zhan, Z.; Li, H.; Dong, X.; Cheng, F.; Piao, Z.; Brassica rapa orphan genes largely affect soluble sugar metabolism.  Hortic. Res. 2020, 7, 1–12.  35. Sola, I.; Stic, P.; Rusak, G. Effect of flooding and drought on the content of phenolics, sugars, photosynthetic pigments and  vitamin C, and antioxidant potential of young Chinese cabbage. Eur. Food Res. Technol. 2021, 247, 1913–1920.  36. Piazzon, A.; Vrhovsek, U.; Masuero, D.; Mattivi, F.; Mandoj, F.; Nardini, M. Antioxidant Activity of Phenolic Acids and Their  Metabolites: Synthesis and Antioxidant Properties of the Sulfate Derivatives of Ferulic and Caffeic Acids and of the Acyl Glu‐ curonide of Ferulic Acid. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 12312–12323.  37. Orsak, M.; Kotikova, Z.; Hnilicka, F.; Lachman, J.; Stanovic, R. Effect of drought and waterlogging on hydrophilic antioxidants  and their activity in potato tubers. Plant Soil Environ. 2020, 66, 128–134.  38. Laddomada, B.; Blanco, A.; Mita, G.; DʹAmico, L.; Singh, R.P.; Ammar, K.; Crossa, J.; Guzmán, C. Drought and Heat Stress  Impacts on Phenolic Acids Accumulation in Durum Wheat Cultivars. Foods 2021, 10, 2142.  39. Hartmann, M.; Kim, D.; Bernsdorff, F.; Ajami‐Rashidi, Z.; Scholten, N.; Schreiber, S.; Zeier, T.; Schuck, S.; Reichel‐Deland, V.;  Zeier, J. Biochemical Principles and Functional Aspects of Pipecolic Acid Biosynthesis in Plant Immunity. Plant Physiol. 2017,  174, 124–153.  40. Wang, P.; Luo, Q.; Yang, W.C.; Ahammed, G.J.; Ding, S.T.; Chen, X.Y.; Wang, J.; Xia, X.J.; Shi, K. A Novel Role of Pipecolic Acid  Biosynthetic Pathway in Drought Tolerance through the Antioxidant System in Tomato. Antioxidants 2021, 10, 1923.  41. Herrmann, K.M. The Shikimate Pathway as An Entry to Aromatic Secondary Metabolism. Plant Physiol. 1995, 107, 7–12.  42. Passarinho, J.A.P.; Lamosa, P.; Baeta, J.P.; Santos, H.; Ricardo, C.P.P. Annual changes in the concentration of minerals and or‐ ganic compounds of Quercus suber leaves. Physiol. Plant. 2006, 127, 100–110.  43. Aranda, I.; Cadahia, E.; Fernandez de Simon, B. Specific leaf metabolic changes that underlie adjustment of osmotic potential  in response to drought by four Quercus species. Tree Physiol. 2021, 41, 728–743.  44. Zhang, J.; Su, Y.; Li, J.; Ren, Z.; Tian, G.; Wang, J. Untargeted GC‐TOFMS Analysis Reveals Metabolomic Changes in Salvia  miltiorrhiza Bunge Leaf and Root in Response to Long‐Term Drought Stress. Horticulturae 2021, 7, 175.  45. Rahmati, M.; Vercambre, G.; Davarynejad, G.; Bannayan, M.; Azizi, M.; Genard, M. Water scarcity conditions affect peach fruit  size and polyphenol contents more severely than other fruit quality traits. J. Sci. Food Agric. 2015, 95, 1055–1065.  46. Li, P.‐C.; Yang, X.‐Y.; Wang, H.‐M.; Pan, T.; Yang, J.‐Y.; Wang, Y.‐Y.; Xu, Y.; Yang, Z.‐F.; Xu, C.‐W. Metabolic responses to com‐ bined water deficit and salt stress in maize primary roots. J. Integr. Agric. 2021, 20, 109–119.  47. Roberts, M.R. Does GABA Act as a Signal in Plants? Hints from Molecular Studies. Plant Signal Behav. 2007, 2, 408–409.  48. Hasan, M.M.; Alabdallah, N.M.; Alharbi, B.M.; Waseem, M.; Yao, G.; Liu, X.D.; Abd El‐Gawad, H.G.; El‐Yazied, A.A.; Ibrahim,  M.F.M.; Jahan, M.S.; et al. GABA: A Key Player in Drought Stress Resistance in Plants. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10136.  49. Bown, A.W.; Shelp, B.J. Plant GABA: Not Just a Metabolite. Trends Plant Sci. 2016, 21, 811–813.  50. Xu, B.; Long, Y.; Feng, X.; Zhu, X.; Sai, N.; Chirkova, L.; Betts, A.; Herrmann, J.; Edwards, E.J.; Okamoto, M.; et al. GABA signal‐ ling modulates stomatal opening to enhance plant water use efficiency and drought resilience. Nat. Commun. 2021, 12, 1–13.  51. Yong, B.; Xie, H.; Li, Z.; Li, Y.‐P.; Zhang, Y.; Nie, G.; Zhang, X.‐Q.; Ma, X.; Huang, L.‐K.; Yan, Y.‐H.; et al. Exogenous Application  of GABA Improves PEG‐Induced Drought Tolerance Positively Associated with GABA‐Shunt, Polyamines, and Proline Metab‐ olism in White Clover. Front. Physiol. 2017, 8, 1107.  52. Tang, M.; Li, Z.; Luo, L.; Cheng, B.; Zhang, Y.; Zeng, W.; Peng, Y. Nitric Oxide Signal, Nitrogen Metabolism, and Water Balance  Affected by gamma‐Aminobutyric Acid (GABA) in Relation to Enhanced Tolerance to Water Stress in Creeping Bentgrass. Int.  J. Mol. Sci. 2020, 21, 7460.  53. Abd El‐Gawad, H.G.; Mukherjee, S.; Farag, R.; Abd Elbar, O.H.; Hikal, M.; Abou El‐Yazied, A.; Abd Elhady, S.A.; Helal, N.;  ElKelish, A.; El Nahhas, N.; et al. Exogenous gamma‐aminobutyric acid (GABA)‐induced signaling events and field perfor‐ mance associated with mitigation of drought stress in Phaseolus vulgaris L. Plant Signal. Behav. 2021, 16, 1853384.  54. Zhang, P.; Fan, Y.; Sun, X.; Chen, L.; Terzaghi, W.; Bucher, E.; Li, L.; Dai, M. A large‐scale circular RNA profiling reveals universal  maize and Arabidopsis. Plant J. 2019, 98, 697–713.  molecular mechanisms responsive to drought stress in  55. Yuan, Y.; Ren, S.; Liu, X.; Su, L.; Wu, Y.; Zhang, W.; Li, Y.; Jiang, Y.; Wang, H.; Fu, R.; et al. SlWRKY35 positively regulates  carotenoid biosynthesis by activating the MEP pathway in tomato fruit. New Phytol. 2022, 234, 164–178.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  18  of  18  56. Chen, W.; Gong, L.; Guo, Z.L.; Wang, W.S.; Zhang, H.Y.; Liu, X.Q.; Yu, S.B.; Xiong, L.Z.; Luo, J. A Novel Integrated Method for  Large‐Scale  Detection,  Identification,  and  Quantification  of  Widely  Targeted  Metabolites: Application  in  the  Study  of  Rice  Metabolomics. Mol. Plant 2013, 6, 1769–1780.  57. Kanehisa, M.; Goto, S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 27–30.  58. Bylesjo, M.; Rantalainen, M.; Cloarec, O.; Nicholson, J.K.; Holmes, E.; Trygg, J. OPLS discriminant analysis: Combining the  strengths of PLS‐DA and SIMCA classification. J. Chemom. 2006, 20, 341–351.  59. Chen, C.; Chen, H.; Zhang, Y.; Thomas, H.R.; Frank, M.H.; He, Y.; Xia, R. TBtools: An Integrative Toolkit Developed for Inter‐ active Analyses of Big Biological Data. Mol. Plant 2020, 13, 1194–1202.  http://www.deepdyve.com/assets/images/DeepDyve-Logo-lg.png International Journal of Molecular Sciences Multidisciplinary Digital Publishing Institute

Comparative Metabolic Study of Two Contrasting Chinese Cabbage Genotypes under Mild and Severe Drought Stress

Download PDF
18 pages

Loading next page...
 
/lp/multidisciplinary-digital-publishing-institute/comparative-metabolic-study-of-two-contrasting-chinese-cabbage-GLQhoBXL5K

References

References for this paper are not available at this time. We will be adding them shortly, thank you for your patience.

Publisher
Multidisciplinary Digital Publishing Institute
Copyright
© 1996-2022 MDPI (Basel, Switzerland) unless otherwise stated Disclaimer The statements, opinions and data contained in the journals are solely those of the individual authors and contributors and not of the publisher and the editor(s). MDPI stays neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations. Terms and Conditions Privacy Policy
ISSN
1422-0067
DOI
10.3390/ijms23115947
Publisher site
See Article on Publisher Site

Abstract

Article  Comparative Metabolic Study of Two Contrasting Chinese  Cabbage Genotypes under Mild and Severe Drought Stress  1 2 1 1 1 1 1 1, Lin Chen  , Yongrui Shen  , Wenjing Yang  , Qiming Pan  , Chao Li  , Qingguo Sun  , Qi Zeng  , Baohua Li  * and  1, Lugang Zhang  *    State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Area, College of Horticulture,   Northwest A&F University, Yangling 712100, China; chenlin1995@nwafu.edu.cn (L.C.);   yangwenjing@nwafu.edu.cn (W.Y.); 2020055340@nwsuaf.edu.cn (Q.P.); lc1999@nwsuaf.edu.cn (C.L.);  qguosun@nwafu.edu.cn (Q.S.); zengqi@nwafu.edu.cn (Q.Z.)    College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;   shenyongrui0926@nwafu.edu.cn  *  Correspondence: baohuali@nwafu.edu.cn (B.L.); lugangzh@nwafu.edu.cn (L.Z.)  Abstract: Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis) is an important leafy vegetable crop cul‐ tivated worldwide. Drought is one of the most important limiting factors for the growth, production  and quality of Chinese cabbage due to its weak drought tolerance. In order to deepen the under‐ standing of drought stress response in Chinese cabbage, metabolomics studies were conducted in  drought−tolerant (DT) and drought−susceptible (DS) genotypes of Chinese cabbage under water  deficit−simulated mild and severe drought stress conditions. A total of 777 metabolites were de‐ tected, wherein 90 of them were proposed as the drought−responsive metabolites in Chinese cab‐ bage, with abscisic acid (ABA), serine, choline alfoscerate, and sphingosine as potential representa‐ tive drought stress biomarkers. We also found that drought−tolerant and drought−susceptible gen‐ otypes  showed  differential  metabolic  accumulation  patterns  with  contrasting  drought  response  mechanisms.  Notably,  constitutively  high  levels  of  ABA  and  glutathione  were  detected  in  Citation: Chen, L.; Shen, Y.; Yang,  drought−tolerant genotype in all tested and control conditions. In addition, proline, sucrose, γ−ami‐ W.; Pan, Q.; Li, C.; Sun, Q.; Zeng, Q.;  nobutyric acid, and glutathione were also found to be highly correlated to drought tolerance. This  Li, B.; Zhang, L. Comparative   study is the first metabolomic study on how Chinese cabbage responds to drought stress, and could  Metabolic Study of Two Contrasting  provide insights on how to develop and cultivate new drought−resistant varieties.  Chinese Cabbage Genotypes under  Mild and Severe Drought Stress. Int.  Keywords: Chinese cabbage; drought stress; metabolome; abscisic acid; glutathione  J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947. https://  doi.org/10.3390/ijms23115947  Academic Editor: Vicent Arbona  Received: 4 May 2022  1. Introduction  Accepted: 23 May 2022  Drought is one of the major environmental factors affecting agricultural production  Published: 25 May 2022  and food security, especially in arid and semi−arid areas where water supply is a major  Publisher’s  Note:  MDPI  stays  neu‐ challenge [1,2]. Thus, developing new crop varieties with low water consumption is crit‐ tral  with  regard  to  jurisdictional  ical for sustaining agriculture and the environment [1].  claims in published maps and institu‐ Chinese cabbage, a fresh leafy vegetable with a high leaf water content and shallow  tional affiliations.  root system, is widely cultivated and consumed around the world, especially in East Asia  where the shortage of fresh water is a major challenge for agriculture. Therefore, it is of    great importance to increase the drought tolerance of Chinese cabbage for its stable pro‐ duction. Genetic and molecular breeding has become increasingly important for improv‐ Copyright: © 2022 by the authors. Li‐ ing drought tolerance of crops, including Chinese cabbage [3,4], and the understanding  censee  MDPI,  Basel,  Switzerland.  of  the  plant’s  drought  response  would  provide  theoretical  framework  for  breeding  This article  is an open access article  drought−resistant varieties.  distributed under the terms and con‐ ditions of the Creative Commons At‐ Plants produce huge numbers of metabolites in order to sustain their growth and  tribution (CC BY) license (https://cre‐ reproduction, as well as adapt to biotic and abiotic stresses. As plants are physically fixed  ativecommons.org/licenses/by/4.0/).  and cannot move, their metabolic responses are key survival tools to deal with various  Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947. https://doi.org/10.3390/ijms23115947  www.mdpi.com/journal/ijms  Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  2  of  18  environment stresses. In recent years, technological advances have been greatly devel‐ oped and utilized to study plants in omics−based approaches, and metabolomics has be‐ come an efficient and important approach to gain panoramic views of how plants respond  to stresses at the whole metabolism level [5,6]. However, there are only RNA−seq studies  of Chinese cabbage’s responses to drought stress on the transcriptional level, while the  metabolic responses at the whole metabolome level have not been reported yet [7–9].  A  large  number  of  metabolomics  studies  have  been  conducted  to  reveal  drought  stress responses in different plant species, and their metabolisms have been significantly  affected by drought stress [10–13]. In Chinese cabbage, previous studies have shown that  drought significantly influences the accumulation of multiple diverse groups of metabo‐ lites including glucosinolates, polyphenols, flavonoids, total antioxidant enzyme activi‐ ties, catalases, and peroxidases in Chinese cabbage [9,14]. Therefore, we propose that Chi‐ nese cabbage may also systemically respond to drought stress at the metabolic level.  In this study, we characterized metabolic responses in two Chinese cabbage geno‐ types with contrasting drought tolerance under mild and severe drought by widely tar‐ geted metabolome technology. This study aimed to (i) identify drought−responsive me‐ tabolites and potential drought stress biomarkers in Chinese cabbage; (ii) compare the  metabolic responses of Chinese cabbage genotypes with contrasting drought tolerance  under mild and severe drought; and (iii) explore potential metabolites associated with  increased drought tolerance and propose a metabolic response framework in Chinese cab‐ bage under drought stress.  2. Results  2.1. Screening for Drought Tolerant and Susceptible Genotypes of Chinese Cabbage  The seed germination rate of 27 Chinese cabbage inbred lines was observed under  20% polyethylene glycol (PEG−6000) and two lines with extreme phenotypic variations  were identified, with 14S837 having the highest germination rate (~80%) while 88S148  having no seed germination (Figure S1). These two lines were selected as candidates rep‐ resenting drought−tolerant (DT) and drought−susceptible (DS) genotypes, respectively.  The phenotypes of the candidate lines were further studied and validated at the seed‐ ling stage under mild and severe drought conditions. Drought stress intensity was deter‐ mined by monitoring soil water content (SWC), and mild drought (50~55% SWC) and se‐ vere drought (30~35% SWC) were achieved after 3 days and 5 days without watering, in  our controlled growth chamber, respectively (Figure 1a). We found that these two lines  had no visible phenotypic alterations when exposed to mild drought, though the leaf wa‐ ter content of 88S148 decreased significantly compared with that of the control plants.  Under severe drought conditions, no visible phenotypic changes were observed in 14S837,  but leaf water content began to decrease. In direct contrast, 88S148 showed severe wilting  symptoms and a lower leaf water content (Figure 1b,c). Additionally, the water loss in  detached shoots was measured, and the data showed that the shoots of 14S837 lost water  more slowly than 88S148 (Figure 1d). With the above data from studying seed and seed‐ ling phenotypes under drought stress conditions, 14S837 and 88S148 were selected as DT  and DS genotypes of Chinese cabbage, respectively, for subsequent metabolomics studies.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  3  of  18  Figure 1. Phenotypic screening and investigations of drought−susceptible (DS) and drought−toler‐ ant (DT) genotypes. (a) Soil water content during drought stress. Sampling time labeled in red; (b)  Morphology of DS and DT after 3 and 5 days without watering. Scale bars, 7 cm; (c) Leaf water  content of DS and DT after 3 and 5 days without watering. Statistical differences are indicated with  lowercase letters determined by Duncan’s test at P < 0.05. (d) Water loss of DS and DT. All data are  shown as means ± SE with three independent biological replicates.  2.2. Metabolome Profiling  To investigate the metabolic response to drought stress in Chinese cabbage, leaf sam‐ ples of DS and DT were collected from day 3 and day 5 drought−treatment plants along‐ side the controls, and total plant metabolites were extracted and analyzed using a widely  targeted  metabolome  analysis  based  on  an  ultra−performance  liquid  chromatog‐ raphy−tandem mass spectrometry (UPLC−MS/MS) platform. A total of 777 metabolites  were detected in all 24 samples in our drought assay, and they could be further divided  into 14 classes, including 147 phenolic acids, 140 lipids, 94 flavonoids, 86 amino acids and    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  4  of  18  derivatives, 75 alkaloids, 61 organic acids, 50 nucleotides and derivatives, 34 saccharides  and alcohols, 28 lignans and coumarins, 18 vitamins, 12 glucosinolates, eight terpenoids,  two quinones, and 22 other metabolites (Figure 2a, TableS1). A total of 371 metabolites  were annotated using the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) compound  database, and 252 metabolites were further mapped to plant metabolic pathways using  the KEGG pathway database.  The total ion current (TIC) of different quality control (QC) samples showed highly  overlapping patterns in retention time and peak intensity, confirming the data was stable  and repeatable at the tested time points (Figure S2). Principal component analysis (PCA)  was carried out to visualize the overall metabolic differences and relationship among sam‐ ples. The PCA of all samples (including QC samples) showed little variation within each  group, but large variation between groups (Figure 2b). The two major components of PCA  explained 47.4% of the total variance, and the first principal component (PC1) explained  29.72% of the total variation, thus separating the two contrasting groups of DS and DT  unambiguously. Separation between the drought treatment and control groups indicated  drought treatment significantly affected the metabolism of the two lines, suggesting our  methodology correctly reveals the metabolic basis of drought stress. A heatmap based on  Pearson’s correlation coefficient between all samples (including QC samples) was also  constructed  (Figure  2c),  showing  a  highly  significant  positive  correlation  among  three  tested biological replicates. On the whole, our experimental design and data are solid and  well suited for downstream analysis.   Figure 2. Metabolic profiling of drought−tolerant and susceptible genotypes in response to mild and  severe drought stress. (a) Number of metabolites and differential metabolites in different classes.  The statistical significance was determined via hypergeometric test with * P < 0.05; (b) Principal    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  5  of  18  component analysis (PCA); (c) Heatmap of Pearson’s correlation coefficient. Different colors repre‐ sent different samples, DS−3d (pink), DS−3d−CK (baby blue), DS−5d(orange), DS−5d−CK (green),  DT−3d (purple), DT−3d−CK (dark blue), DT−5d (lightsalmon), DT−5d−CK (dark green), mix (golden  yellow).  2.3. Differential Metabolites in Multiple Comparison Groups  To identify differential metabolites (DMs), orthogonal partial least squares discrimi‐ nant  analysis  (OPLS−DA)  was  performed  in  12  comparison  groups  and  variable  im‐ portance in projection (VIP) values were obtained. DMs were determined by fold changes  (FC) ≥1.5 or ≤0.67 and VIP ≥ 1, and a total of 597 DMs were identified in all tested compar‐ ison groups, providing the core DMs data for subsequent analysis (Figure 3a, Table S2).   In  order  to  understand  the  dynamics  of  DMs  in  different  comparison  groups,  K−means cluster analysis was performed based on the accumulation patterns of different  metabolites, and six sub−classes were identified (Figure 3b, Table S3). A total of 137, 73,  92, 96, 66, and 133 metabolites were clustered from sub−classes 1 to 6, respectively. Nota‐ bly, DMs in sub−class 4 and 5 show higher accumulation under severe drought conditions,  suggesting  that these  metabolites  might  be  top  metabolic  candidate  biomarkers  in the  drought response of Chinese cabbage.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  6  of  18  Figure 3. Analysis of differential metabolites (DMs). (a) Number of upregulated and downregulated  DMs in 12 comparison groups; (b) The K−means analysis of DMs.  2.4. Exploration of Key Drought−Responsive Metabolites in Chinese Cabbage  To explore the metabolic response of Chinese cabbage under drought stress, we first  examined  the  variation  of  DMs  in  four  comparison  groups  (DS−3d−CK  vs.  DS−3d,  DS−5d−CK vs. DS−5d, DT−3d−CK vs. DT−3d, DT−5d−CK vs. DT−5d), and a total of 291  DMs were detected in the above four comparison groups (Table S2). Among the 291 me‐ tabolites, 27.89% (41/147) phenolic acids, 30% (42/140) lipids, 15.96% (15/94) flavonoids,  65.12% (56/86) amino acids and derivatives, 50.67% (38/75) alkaloids, 50.82% (31/61) or‐ ganic acids, 72% (36/50) nucleotides and derivatives, 41.18% (14/34) saccharides and alco‐ hols, 21.43% (6/28) lignans and coumarins, 27.78% (5/18) vitamin, 41.67% (5/12) glucosin‐ olates, and 9.09% (2/22) other metabolites, they showed differential accumulation patterns  in response to drought stress (Figure 2a). Notably, amino acids and derivatives, alkaloids,  organic  acids,  and  nucleotides  and  derivatives,  were  significantly  affected  by  drought  stress. KEGG pathway enrichment analysis indicated that DMs responding to drought    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  7  of  18  stress were significantly enriched in 13 pathways including purine metabolism, 2−oxocar‐ boxylic acid metabolism, metabolic pathways, glyoxylate and dicarboxylate metabolism,  biosynthesis of amino acids, aminoacyl−tRNA biosynthesis, lysine biosynthesis, carbon  metabolism, ABC transporters, lysine degradation, the citrate cycle (TCA cycle), arginine  biosynthesis, and tryptophan metabolism (Figure 4).  Figure 4. KEGG pathway analysis of 291 differential metabolites of drought−tolerant and suscepti‐ ble genotypes in response to drought stress.  Venn diagrams were constructed to show the number of common DMs in both lines  under mild drought and severe drought stress conditions. Five common upregulated and  five common downregulated DMs were found in DS and DT under mild drought, while  55 common DMs were upregulated and 14 common DMs were downregulated in both DS  and DT under severe drought (Figure 5a,b). Four common DMs in both genotypes and  drought conditions, abscisic acid (ABA), serine, choline alfoscerate (GPC), and sphingo‐ sine, were proposed as potential biomarkers of drought stress in Chinese cabbage. Fur‐ thermore, 28 common upregulated and eight common downregulated DMs were specifi‐ cally  altered  in  DS−3d  vs.  DS−5d  and  DT−3d  vs.  DT−5d  but  not  in  DS−3d−CK  vs.  DS−5d−CK and DT−3d−CK vs. DT−5d−CK (Figure 5c,d, Table S2). These common DMs    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  8  of  18  with similar response patterns to drought stress in both genotypes were considered to be  the drought−responsive metabolites. By removing the duplicated metabolites, a total of 90  metabolites,  with  68  upregulated  and  22  downregulated  ones,  were  selected  and  pro‐ posed  as  the  drought−responsive  metabolites  in  Chinese  cabbage  (Figure  6,  Table  S4).  Among these drought−responsive metabolites, 24 metabolites were classified as amino  acids and derivatives. Thus, we further investigated the levels of free amino acids under  drought stress. Serine levels were increased in both drought treatments and genotypes.  Proline, leucine, isoleucine, methionine, and tyrosine showed a similar response pattern  with higher accumulation under severe drought treatment in both genotypes. The aspartic  acid levels were higher in DT irrelevant of drought treatment and were specifically de‐ creased in DT upon severe drought. Other amino acids, including threonine, asparagine,  cysteine and glutamic acid, were found to be unaffected by drought stress.   Figure 5. Venn diagrams showing the numbers of upregulated (a,c) and downregulated (b,d) dif‐ ferential metabolites (DMs) in different comparison groups. The metabolites labeled in red are con‐ sidered as the drought−responsive metabolites.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  9  of  18  Figure 6. Heatmap of 90 drought−responsive metabolites in Chinese cabbage was constructed based  on  Log2  ratios  of  fold  changes.  The  metabolites  labeled  in  red  were  considered  as  potential  bi‐ omarkers of drought stress in Chinese cabbage. The Log2 (fold changes values) and the color scale  are shown at the bottom right of heatmap.  In conclusion, we identified a large number of metabolites involved in the drought  responses of Chinese cabbage, among which, amino acids and derivatives played more  important roles in the drought responses.  2.5. Differential Drought Responses between DS and DT Genotypes  In order to study the differential response of DS and DT to drought stress, KEGG  pathway enrichment analysis was performed for DMs in four comparison groups (Figure  7). 59 DMs (36 upregulated and 23 downregulated) were found in DS−3d−CK vs. DS−3d,  which were enriched in glycerophospholipid metabolism, sphingolipid metabolism, and  plant hormone signal transduction, whereas 98 DMs (39 upregulated and 59 downregu‐ lated) were found in DT−3d−CK vs. DT−3d enriched in carbon metabolism, carbon fixa‐ tion in photosynthetic organisms, glyoxylate and dicarboxylate metabolism, glycerolipid  metabolism, starch and sucrose metabolism, biosynthesis of secondary metabolites, met‐ abolic pathways, galactose metabolism, and the TCA cycle (Figures 3a and 7a,b). In the  mild drought stress, there were more DMs in DT, especially more downregulated DMs,  indicating that mild drought stress had a stronger effect on DT.   Under 5−day drought treatment, there were 151 DMs (111 upregulated and 40 down‐ regulated) in DS, which mainly involved in aminoacyl−tRNA biosynthesis, glucosinolate  biosynthesis, glycerophospholipid metabolism, biosynthesis of amino acids, tropane, pi‐ peridine, pyridine alkaloid biosynthesis, ABC transporters, metabolic pathways, lysine  degradation, and 2−oxocarboxylic acid metabolism. In comparison, 165 DMs (111 upreg‐ ulated and 54 downregulated) were identified in DT, enriched in purine metabolism, TCA    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  10  of  18  cycle, metabolic pathways, carbon metabolism, pyruvate metabolism, carbon fixation in  photosynthetic organisms, 2−oxocarboxylic acid metabolism, and glyoxylate and dicar‐ boxylate  metabolism  (Figures  3a  and  7c,d).  Notably,  the  differential  abundance  (DA)  scores of DT were mostly negative in the enrichment pathways under mild drought and  severe drought conditions (Figure 7b,d), while the scores in DS were mostly positive in  the enrichment pathways (Figure 7a,c).  Figure 7. KEGG pathway enrichment analysis and differential abundance (DA) scores of differential  metabolites (DMs) in four comparison groups. (a) DS−3d−CK vs. DS−3d; (b) DT−3d−CK vs. DT−3d;  (c) DS−5d−CK vs. DS−5d; (d) DT−5d−CK vs. DT−5d.  To further explore the different metabolic response patterns of the two selected con‐ trasting Chinese cabbage genotypes, a comparative metabolic analysis between DS and  DT was performed (Figure 8, Table S2). Fifty−nine metabolites accumulated more in DT,  especially some of the key drought−responsive metabolites, such as ABA, GPC, and re‐ duced glutathione, which may explain the increased drought tolerance observed in DT  (Figure 8a). Furthermore, 84 common DMs showed higher accumulation in DS in both  drought and control conditions compared with the ones in DT, including 25 phenolic ac‐ ids and 25 flavonoids, thus indicating DS contains more phenolic acids and flavonoids  (Figure 8b).    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  11  of  18  Figure 8. Venn diagram showing the number of upregulated (a) and downregulated (b) differential  metabolites (DMs) between DS and DT under control and drought conditions.  3. Discussion  As sessile organisms, plants need to respond to the great challenges of environmental  stresses, among which, drought is one of the most severe ones, especially in the large arid  and  semi−arid  areas  located  primarily  in  the  developing  countries  and  regions  of  the  world [2]. Understanding  the  plants’ drought  responses  can  not  only  help  our  under‐ standing of how different plant species mitigate drought stresses, but also provide in‐ sights to crop breeding for high water use efficiency and for crop security within econom‐ ically vulnerable populations. Metabolites are the key tools for plants to facilitate water  use, especially in leafy vegetables like Chinese cabbage, which require large quantities of  water but have a limited ability to extract water from soil. In this current study, we ana‐ lyzed the metabolome of two Chinese cabbage genotypes with different drought tolerance  abilities and found that amino acids and derivatives, alkaloids, organic acids, and nucle‐ otides and derivatives in Chinese cabbage were significantly affected by drought stress.  A total of 777 metabolites were detected by a widely targeted metabolome and 90 metab‐ olites were selected and proposed as the drought−responsive metabolites in Chinese cab‐ bage, with ABA, serine, choline alfoscerate, and sphingosine as potential representative  drought stress biomarkers. In addition, we also found that DS and DT have different me‐ tabolite response patterns and contrasting coping strategies in response to drought stress,  which might explain their corresponding phenotypic differences under drought stress.  Notably,  constitutively  high  levels  of  ABA  and  glutathione  were  detected  in  the  drought−tolerant genotype in all tested and control conditions, which might help explain  the increased drought tolerance of DT. A simplified drought response model in Chinese  cabbage was proposed according to our study.  The plant hormone ABA plays a central role in response to abiotic stress by modu‐ lating stomata, plant growth, and metabolic pathways [15,16]. In our study, ABA was  shown to be the most important metabolite in Chinese cabbage for responding to drought  stress. We found that the level of ABA increased rapidly under drought stress in both  genotypes. More importantly, the level of ABA in DT was higher than the one in DS under  both drought and control conditions. Thus, the differential levels of ABA may explain the  contrasting phenotypic differences observed, though the mechanism of ABA accumula‐ tion in DT requires further investigation.  Some important intermediates in the TCA cycle, including citric acid, isocitric acid,  α−ketoglutaric acid, succinic acid, and malic acid, were shown to have a lower accumula‐ tion in DT under drought stress, indicating that the TCA cycle was inhibited by water  deficiency. This is consistent with downregulation of enriched metabolic pathways in DT  and may be related to the drought acclimation ability of DT. Furthermore, it has been  shown that citric acid can confer abiotic stress tolerance in plants, and exogenous citric    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  12  of  18  acid application can also enhance drought tolerance in a variety of plant species [17–20].  Therefore, increasing endogenous citric acid level by exogenous spray may be a poten‐ tially useful approach for improving the drought tolerance of Chinese cabbage.  Proline has been reported in multiple studies as another important drought−respon‐ sive metabolite [13,21–23]. Beyond acting as an osmolyte for osmotic adjustment, proline  also stabilizes sub−cellular structures and contributes to reactive oxygen species (ROS)  detoxification [24]. Although we did not observe changes in proline levels under mild  drought stress, the concentration increased under severe drought condition in both geno‐ types. Serine, which is required for cysteine and methionine biosynthesis, was proposed  as one of the potential biomarkers of drought stress in Chinese cabbage. Methionine, the  precursor of aliphatic glucosinolates, showed increased levels under severe drought con‐ dition in both DS and DT, which may explain why the aliphatic glucosinolates increased  under drought stress. Aspartic acid can be transformed from oxaloacetate, an intermedi‐ ate in the TCA cycle that can be catalyzed by aspartate aminotransferase [25]. Thus, the  decreased levels of aspartic acid in DT may be a result of downregulation of other inter‐ mediates in the TCA cycle.  Glutathione (GSH) is a non−protein tripeptide involved in the detoxification of excess  ROS, maintaining cellular redox homeostasis and regulating protein function in plants  under abiotic and biotic stresses [26–28]. Reduced GSH is oxidized to disulfide (GSSG)  during ROS scavenging, and GSSG is recycled to GSH by glutathione reductase [24]. Pre‐ vious studies have shown that the levels of GSH increase in response to drought stress  [29]. Furthermore, exogenously applied and endogenously increased GSH can improve  drought stress tolerance in many plant species [27,30–32]. While we found no significant  changes in the content of GSH in our drought assay, the plants accumulated more GSH in  the severe drought stress condition. Moreover, the level of GSH was higher in DT inde‐ pendent of the stress, which may be related to its increased drought tolerance. Further‐ more, S−(methyl) glutathione, the thioether of glutathione [33], was induced by drought  stress, and its role in the drought response of Chinese cabbage warrants further investi‐ gation.  Soluble sugars mainly include sucrose and its products glucose and fructose [34]. It  was found that drought increased the amount of soluble sugar in Chinese cabbage [35].  In this study, we discovered that drought stress increased sucrose levels in Chinese cab‐ bage but did not significantly affect the levels of glucose and fructose, which suggests that  sucrose plays important roles in osmotic adaption under drought stress.  Phenolic acids, a major class of polyphenols, are constitutively present in vegetables  with strong antioxidant activity [36,37]. Drought stress enhanced the accumulation of phe‐ nolic acids [29,38]. In this study, we identified a total of 147 phenolic acids, and nine phe‐ nolic acids were considered to be involved in the response to drought stress of Chinese  cabbage, including 4−methylphenol, 2−hydroxy−3−phenylpropanoic acid, 3−(4−hydroxy‐ phenyl)−propionic  acid,  p−coumaric  acid  methyl  ester,  methyl  sinapate,  sin‐ apoyl−4−O−glucoside,  curculigine,  sinapoylsinapoyltartaric  acid,  and  1−O−caffeoyl−(6−O−glucosyl)−β−D−glucose. Interestingly, we found that nearly half of the  39 upregulated metabolites in the DT−3d−CK vs. DT−3d comparison group were phenolic  acids, which may improve the drought tolerance of DT by increasing antioxidant activity  in the early stages of drought stress (Table S2).  Pipecolic acid is a lysine−derived non−protein amino acid which regulates plant sys‐ temic acquired resistance and basal immunity to bacterial pathogen infection [39]. Recent  study has shown that pipecolic acid plays a negative regulatory role in drought tolerance  of tomato plants [40]. In this study, the level of DL−pipecolic acid in DT decreased under  mild drought stress, which may be related to the drought resistance response in DT.   Quinic acid is a cyclic carboxylic acid involved in the shikimate pathway [41]. It was  reported that quinic acid is the main contributor to the osmotic potential of Quercus suber  leaves [42], and its concentration increased under drought stress in some species [23,43].  However, the level of quinic acid decreased in both genotypes under mild drought and    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  13  of  18  further decreased with the aggravation of drought in DT. This result was in accordance  with a report on broccoli [22], Salvia miltiorrhiza Bunge (Danshen) [44], peach [45] and  maize [46]. Especially in broccoli, low levels of quinic acid were considered to be an im‐ portant signature of drought tolerance [22]. Consequently, the effect of quinic acid in re‐ sponse to drought needs to be further studied.  γ−aminobutyric acid (GABA), a non−protein amino acid, functions as an intrinsic sig‐ naling molecule and accumulates quickly in response to a variety of abiotic stresses in  plants [47–49]. Research has suggested that GABA can reduce stomatal opening and tran‐ spiration water loss by negatively regulating the activity of a stomatal guard cell tono‐ plast−localized  anion  transporter  ALMT9,  thus  improving  water  use  efficiency  and  drought tolerance [50]. Exogenous GABA application can increase drought tolerance in  many plant species, e.g., white clover [51], creeping bentgrass [52], and snap bean [53].  However, little is known about the roles of GABA in Chinese cabbage. To our knowledge,  this study is the first to report that drought stress can induce GABA accumulation in Chi‐ nese cabbage. In parallel with previous research, the roles and mechanisms of GABA in  the drought response of Chinese cabbage must be further studied.  Based on our findings, we propose a simplified model on how the drought−tolerant  genotype of Chinese cabbage responds to mild and severe stresses at the metabolic level  (Figure 9).  Figure 9. The outline of drought−tolerant genotype responses to drought stress. The red represents  increased, while the green represents decreased. ABA, abscisic acid; IAA, indole 3−acetic acid; GPC,  choline alfoscerate; TCA cycle, citrate cycle; GABA, γ−aminobutyric acid; ROS, reactive oxygen spe‐ cies.  4. Materials and Methods  4.1. Plant Materials and PEG Treatment  The seeds of 27 Chinese cabbage inbred lines, including 88S148 and 14S837, were  provided  by  the  Chinese  cabbage  research  group,  College  of  Horticulture,  Northwest  A&F University, Yangling, China.  The  drought  assay  was  conducted  by  screening  seed  germination  under  20%  PEG6000−induced osmotic stress. In brief, 30 seeds of the same size, that were full and  disease−free were picked and disinfected with 75% ethanol for 1 min, followed by 10%  sodium hypochlorite solution (NaClO) for 15 min, then rinsed repeatedly with sterilized  water. Next, the disinfected seeds were spread in a 9 cm diameter petri dish containing  three filter papers as the germination bed, and soaked with 10 mL 20% PEG6000 (10 mL  sterile water as the control), and germinated in a 25 °C light incubator (Dongnan Instru‐ ment Co., Ltd. Ningbo, China). A 1 mL PEG solution per day (sterile water for control)  was supplemented to each dish during germination. The germination rate was counted    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  14  of  18  on the seventh day and three independent biological replicates were performed. All rea‐ gents are purchased from Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China).  4.2. Growth Conditions and Drought Treatment  The seeds were sown in 7 cm pots containing a soil matrix of equal weight. Seedlings  were grown in the light incubator (Dongnan Instrument Co., Ltd. Ningbo, China) at 25 °C  −2 −1  with 14 h light (150 μmol m s of light intensity)/10 h dark cycles and watered normally.  Drought  treatment  was  simulated  by  a  water  deficit.  Briefly,  the  seedlings  were  grown under the conditions described above. The 3−week−old seedlings were watered  until the soil was saturated and did not contain much water. Subsequently, the seedlings  undergoing drought treatment were no longer watered after removing excess water from  the tray.  4.3. Water Loss, Soil Water Content and Leaf Water Content Measurement  Water loss was measured according to a previous method [54]. Briefly, the detached  shoots of 3−week−old seedlings were immediately weighed and recorded eight times at  one−hour intervals. Water loss was expressed as the percentage of initial fresh weight.  Three replicates were performed and each replicate contained six individual plants.  Soil water content was determined by the oven drying method. In brief, the fresh  weight of the soil matrix in the pot was weighed after removing the roots, then the soil  was oven dried at 105 °C for 12 h and weighed again. The soil water content was expressed  by the percentage of weight lost out of the initial fresh weight and recorded at 24 h inter‐ vals. Three replicates were performed and each replicate contained three individual sam‐ ples.  For the measurement of leaf water content, the second leaves were collected and im‐ mediately weighed to obtain the fresh weight (FW), then the leaves were oven dried at 80  °C for 24 h and dry weights (DW) were measured. Leaf water content (%) was calculated  as [(FW − DW)/FW] × 100. Three replicates were performed and each replicate contained  three individual plants.  4.4. Sample Collection  The seedlings of drought−tolerant and susceptible genotypes were grown in a light  incubator with the conditions described above. The second intact leaves counted from  outside to inside were collected from five individual plants when the soil water content  reached 50~55% (drought for 3 d) and 30~35% (drought for 5 d), respectively. The plants  with normal irrigation were also sampled as controls (CK) at the same time. Therefore, a  total  of  four  group  samples  were  collected,  designated  as  DS−3d/DS−3d−CK,  DS−5d/DS−5d−CK, DT−3d/DT−3d−CK, DT−5d/DT−5d−CK, and three independent biolog‐ ical replicates were performed. The collected leaves were snap−frozen in liquid nitrogen  immediately and stored at −80 °C until extraction.   4.5. Metabolome Profiling  Widely targeted metabolome was employed to acquire the metabolomic profile of  samples conducted by Wuhan Metware Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, China). In brief,  the sample leaves were freeze−dried by a vacuum freeze−dryer (Scientz−100F, Ningbo,  China) and crushed using a mixer mill (MM 400, Retsch, Germany) at 30 Hz for 90 s. Ly‐ ophilized powder (100 mg) was weighed and dissolved with 1.2 mL 70% methanol solu‐ tion (vortex 30 s every 30 min and repeated six times), followed by overnight extraction  at 4 °C. Finally, the extract was centrifuged at 12,000 rpm for 10 min, and the supernatant  was collected and filtered through a filter membrane (0.22 μm pore size, ANPEL, Shang‐ hai, China) before UPLC−MS/MS analysis.  The sample extracts were analyzed using an UPLC−ESI−MS/MS system (UPLC, SHI‐ MADZU Nexera X2, Kyoto, Japan; MS, Applied Biosystems 4500 Q TRAP, Waltham, MA,    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  15  of  18  USA). Quality control samples (QC) prepared by mixing all sample extracts were inserted  every 10 samples to monitor the repeatability of the analysis process. UPLC separation  was performed with the same protocol as Yuan et al. [55]. Mass spectrographic analysis  was performed by a triple quadrupole–linear ion trap mass spectrometer equipped with  an ESI Turbo Ion−Spray interface (Applied Biosystems 4500 Q TRAP UPLC/MS/MS Sys‐ tem), which operated according to a previous study [56]. The mass spectrometry data was  processed with the Analyst 1.6.3 software (AB Sciex). Qualitative analysis of metabolites  was identified based on MetWare database (Wuhan Metware Biotechnology Co.,  Ltd.,  Wuhan, China) and other public databases. Quantification of metabolites was carried out  using multiple reaction monitoring method [56].  4.6. Data Analysis  Identified  metabolites  were  annotated  using  the  KEGG  compound  database  (http://www.kegg.jp/kegg/compound/, accessed on 15  November 2021); annotated me‐ tabolites  were  then  mapped  to  the  KEGG  pathway  database  (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html,  accessed  on  15  November  2021)  [57].  KEGG  pathway enrichment analysis was performed using the Metware Cloud, a free online plat‐ form for data analysis (https://cloud.metware.cn, accessed on 10 January 2022) and signif‐ icance was determined by hypergeometric test. The differential abundance (DA) score is  a metabolic change analysis method based on a pathway which can reflect the overall  changes of all differential metabolites in a pathway. DA score is calculated as (number of  upregulated DMs annotated to a pathway−number of downregulated DMs annotated to  the pathway)/number of all metabolites annotated to the pathway.  Multivariate statistical analysis can simplify the high−dimensional and complex data,  and retain the original information to the greatest extent. PCA, a classic unsupervised pat‐ tern recognition multivariate statistical analysis method, was performed by the prcomp  function within R (www.r‐project.org, accessed on 15 November 2021). The data was unit  variance scaled before PCA. OPLS−DA, a supervised pattern recognition method, was  performed by R software using R package MetaboAnalystR [58]. The data was log trans‐ formed (log2) and mean centered before OPLS−DA. In order to avoid overfitting, a per‐ mutation  test  (200  permutations)  was  performed.  VIP  values  were  extracted  from  the  OPLS−DA result to identify DMs.  Pearson correlation coefficients (PCC) and K−means cluster analysis were also per‐ formed with the Metware Cloud. For the K−Means analysis, the relative contents of DMs  in all groups were standardized using the Z−score algorithm. A heatmap of metabolites  was displayed by TBtools [59].  Supplementary  Materials:  The  following  supporting  information  can  be  downloaded  at:  www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23115947/s1.  Author Contributions: Conceptualization, L.C. and B.L.; methodology, L.C. and B.L.; validation,  W.Y., Q.P., Q.Z. and Q.S.; formal analysis, L.C.; investigation, L.C., Y.S. and C.L.; resources, B.L. and  L.Z.; writing−original draft, L.C.; writing−review and editing, B.L. and L.Z.; funding acquisition,  B.L. and L.Z. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.  Funding: This research was funded by the Key Research and Development Program of Yangling  Seed  Innovative  Center  (Ylzy‐sc‐04)  to  L.Z.,  National  Natural  Science  Foundation  of  China  (32070333) to B. L., and Startup Funding (Z111021922) from Northwest A&F University to B.L.  Institutional Review Board Statement: Not applicable.  Informed Consent Statement: Not applicable.  Data Availability Statement: Not applicable.  Acknowledgments: We thank Albert Liu (University of California, Berkeley) for English editing on  the manuscript. We also thank Wuhan Metware Biotechnology Co., Ltd. (Wuhan, China) for provid‐ ing technical support.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  16  of  18  Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.  References  1. Zhu, J.K. Abiotic Stress Signaling and Responses in Plants. Cell 2016, 167, 313–324.  2. Knapp, J. Water use in arid and semi‐arid regions: In the hands of local and watershed‐level managers. J. Soil Water Conserv.  1995, 50, 412–423.  3. Wang, J.Y.; Li, C.N.; Li, L.; Reynolds, M.; Mao, X.G.; Jing, R.L. Exploitation of Drought Tolerance‐Related Genes for Crop Im‐ provement. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10265.  4. Park, B.J.; Liu, Z.C.; Kanno, A.; Kameya, T. Genetic improvement of Chinese cabbage for salt and drought tolerance by consti‐ tutive expression of a B. napus LEA gene. Plant Sci. 2005, 169, 553–558.  5. Zhuang, J.; Zhang, J.; Hou, X.; Wang, F.; Xiong, A.‐S. Transcriptomic, Proteomic, Metabolomic and Functional Genomic Ap‐ proaches for the Study of Abiotic Stress in Vegetable Crops. Crit. Rev. Plant Sci. 2014, 33, 225–237.  6. Tian, H.; Lam, S.M.; Shui, G. Metabolomics, a Powerful Tool for Agricultural Research. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1871.  7. Guo, Y.M.; Samans, B.; Chen, S.; Kibret, K.B.; Hatzig, S.; Turner, N.C.; Nelson, M.N.; Cowling, W.A.; Snowdon, R.J. Drought‐ Tolerant Brassica rapa Shows Rapid Expression of Gene Networks for General Stress Responses and Programmed Cell Death  Under Simulated Drought Stress. Plant Mol. Biol. Report. 2017, 35, 416–430.  8. Yu, S.; Zhang, F.; Yu, Y.; Zhang, D.; Zhao, X.; Wang, W. Transcriptome Profiling of Dehydration Stress in the Chinese Cabbage  (Brassica rapa L. ssp. pekinensis) by Tag Sequencing. Plant Mol. Biol. Report. 2012, 30, 17–28.  9. Eom, S.H.; Baek, S.‐A.; Kim, J.K.; Hyun, T.K. Transcriptome Analysis in Chinese Cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) Provides  the Role of Glucosinolate Metabolism in Response to Drought Stress. Molecules 2018, 23, 1186.  10. Zhao, M.; Ren, Y.; Wei, W.; Yang, J.; Zhong, Q.; Li, Z. Metabolite Analysis of Jerusalem Artichoke (Helianthus tuberosus L.) Seed‐ lings in Response to Polyethylene Glycol‐Simulated Drought Stress. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3294.  11. Fadoul, H.E.; Martínez Rivas, F.J.; Neumann, K.; Balazadeh, S.; Fernie, A.R.; Alseekh, S. Comparative Molecular and Metabolic  Profiling of Two Contrasting Wheat Cultivars under Drought Stress. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 13287.  12. Lawas, L.M.F.; Li, X.; Erban, A.; Kopka, J.; Jagadish, S.V.K.; Zuther, E.; Hincha, D.K. Metabolic responses of rice cultivars with  different tolerance to combined drought and heat stress under field conditions. GigaScience 2019, 8, 1–21.  13. You, J.; Zhang, Y.J.; Liu, A.L.; Li, D.H.; Wang, X.; Dossa, K.; Zhou, R.; Yu, J.Y.; Zhang, Y.X.; Wang, L.H.; et al. Transcriptomic and  ‐tolerant and susceptible sesame genotypes in response to drought stress. BMC Plant Biol.  metabolomic profiling of drought 2019, 19, 267.  14. Shawon, R.A.; Kang, B.S.; Lee, S.G.; Kim, S.K.; Lee, H.J.; Katrich, E.; Gorinstein, S.; Ku, Y.G.; Influence of drought stress on  bioactive compounds, antioxidant enzymes and glucosinolate contents of Chinese cabbage (Brassica rapa). Food Chem. 2020, 308,  125657.  15. Zhang, J.H.; Jia, W.S.; Yang, J.C.; Ismail, A.M.; Role of ABA in integrating plant responses to drought and salt stresses. Field  Crops Res. 2006, 97, 111–119.  16. Hsu, P.‐K.; Dubeaux, G.; Takahashi, Y.; Schroeder, J.I.; Signaling mechanisms in abscisic acid‐mediated stomatal closure. Plant  J. 2021, 105, 307–321.  17. Tahjib‐Ul‐Arif, M.; Zahan, M.I.; Karim, M.M.; Imran, S.; Hunter, C.T.; Islam, M.S.; Mia, M.A.; Hannan, M.A.; Rhaman, M.S.;  Hossain, M.A.; et al. Citric Acid‐Mediated Abiotic Stress Tolerance in Plants. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 7235.  18. Xie, H.; Bai, G.; Lu, P.; Li, H.; Fei, M.; Xiao, B.G.; Chen, X.J.; Tong, Z.J.; Wang, Z.Y.; Yang, D.H. Exogenous citric acid enhances  drought tolerance in tobacco (Nicotiana tabacum). Plant Biol. 2022, 24, 333–343.  19. El‐Tohamy, W.A.; El‐Abagy, H.M.; Badr, M.A.; Gruda, N. Drought tolerance and water status of bean plants (Phaseolus vulgaris  L.) as affected by citric acid application. J. Appl. Bot. Food Qual. 2013, 86, 212–216.  20. Darandeh, N.; Hadavi, E. Effect of pre‐harvest foliar application of citric acid and nnalic acid on chlorophyll content and post‐ harvest vase life of Lilium cv. Brunello. Front. Plant Sci. 2012, 2, 106.  21. Guo, Q.; Li, X.; Li, N.; Jameson, P.E.; Zhou, W. Transcription‐associated metabolomic adjustments in maize occur during com‐ bined drought and cold stress. Plant Physiol. 2021, 186, 677–695.  22. Chevilly, S.; Dolz‐Edo, L.; Lopez‐Nicolas, J.M.; Morcillo, L.; Vilagrosa, A.; Yenush, L.; Mulet, J.M. Physiological and Molecular  Characterization of the Differential Response of Broccoli (Brassica oleracea var. Italica) Cultivars Reveals Limiting Factors for  Broccoli Tolerance to Drought Stress. J. Agric. Food Chem. 2021, 69, 10394–10404.  23. Wan, T.; Feng, Y.; Liang, C.; Pan, L.; He, L.; Cai, Y. Metabolomics and Transcriptomics Analyses of Two Contrasting Cherry  Rootstocks in Response to Drought Stress. Biology 2021, 10, 201.  24. Hayat, S.; Hayat, Q.; Alyemeni, M.N.; Wani, A.S.; Pichtel, J.; Ahmad, A. Role of proline under changing environments: A review.  Plant Signal. Behav. 2012, 7, 1456–1466.  25. Kirsch, J.F.; Eichele, G.; Ford, G.C.; Vincent, M.G.; Jansonius, J.N.; Gehring, H.; Christen, P. Mechanism of action of aspartate  aminotransferase proposed on the basis of its spatial structure. J. Mol. Biol. 1984, 174, 497–525.  26. Koramutla, M.K.; Negi, M.; Ayele, B.T. Roles of Glutathione in Mediating Abscisic Acid Signaling and Its Regulation of Seed  Dormancy and Drought Tolerance. Genes 2021, 12, 1620.  27. Cheng, M.C.; Ko, K.; Chang, W.L.; Kuo, W.C.; Chen, G.H.; Lin, T.P. Increased glutathione contributes to stress tolerance and  global translational changes in Arabidopsis. Plant J. Cell Mol. Biol. 2015, 83, 926–939.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  17  of  18  28. Noctor, G.; Mhamdi, A.; Chaouch, S.; Han, Y.; Neukermans, J.; Marquez‐Garcia, B.; Queval, G.; Foyer, C.H. Glutathione in plants:  An integrated overview. Plant Cell Environ. 2012, 35, 454–484.  29. Sarker, U.; Oba, S. Drought stress enhances nutritional and bioactive compounds, phenolic acids and antioxidant capacity of  Amaranthus leafy vegetable. BMC Plant Biol. 2018, 18, 1–15.  30. Chen, J.H.; Jiang, H.W.; Hsieh, E.J.; Chen, H.Y.; Chien, C.T.; Hsieh, H.L.; Lin, T.P. Drought and salt stress tolerance of an Ara‐ bidopsis glutathione S‐transferase U17 knockout mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid.  Plant Physiol. 2012, 158, 340–351.  31. Raja, V.; Wani, U.M.; Wani, Z.A.; Jan, N.; Kottakota, C.; Reddy, M.K.; Kaul, T.; John, R. Pyramiding ascorbate‐glutathione path‐ way in Lycopersicum esculentum confers tolerance to drought and salinity stress. Plant Cell Rep. 2021, 41, 619–637.  Jia, S.; Yu, D.; Wei, T.; Chen, C.; Song, W. Overexpression of the Glutathione Peroxidase 5 (RcGPX5)  32. Zhang, L.; Wu, M.; Teng, Y.;  Gene from Rhodiola crenulata Increases Drought Tolerance in Salvia miltiorrhiza. Front. Plant Sci. 2019, 9, 1950.  33. Terwilliger, T.C.; Bollag, G.E.; Sternberg, D.W., Jr.; Koshland, D. S‐methyl glutathione synthesis is catalyzed by the cheR me‐ thyltransferase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1986, 165, 958–963.  34. Jiang, M.; Zhan, Z.; Li, H.; Dong, X.; Cheng, F.; Piao, Z.; Brassica rapa orphan genes largely affect soluble sugar metabolism.  Hortic. Res. 2020, 7, 1–12.  35. Sola, I.; Stic, P.; Rusak, G. Effect of flooding and drought on the content of phenolics, sugars, photosynthetic pigments and  vitamin C, and antioxidant potential of young Chinese cabbage. Eur. Food Res. Technol. 2021, 247, 1913–1920.  36. Piazzon, A.; Vrhovsek, U.; Masuero, D.; Mattivi, F.; Mandoj, F.; Nardini, M. Antioxidant Activity of Phenolic Acids and Their  Metabolites: Synthesis and Antioxidant Properties of the Sulfate Derivatives of Ferulic and Caffeic Acids and of the Acyl Glu‐ curonide of Ferulic Acid. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 12312–12323.  37. Orsak, M.; Kotikova, Z.; Hnilicka, F.; Lachman, J.; Stanovic, R. Effect of drought and waterlogging on hydrophilic antioxidants  and their activity in potato tubers. Plant Soil Environ. 2020, 66, 128–134.  38. Laddomada, B.; Blanco, A.; Mita, G.; DʹAmico, L.; Singh, R.P.; Ammar, K.; Crossa, J.; Guzmán, C. Drought and Heat Stress  Impacts on Phenolic Acids Accumulation in Durum Wheat Cultivars. Foods 2021, 10, 2142.  39. Hartmann, M.; Kim, D.; Bernsdorff, F.; Ajami‐Rashidi, Z.; Scholten, N.; Schreiber, S.; Zeier, T.; Schuck, S.; Reichel‐Deland, V.;  Zeier, J. Biochemical Principles and Functional Aspects of Pipecolic Acid Biosynthesis in Plant Immunity. Plant Physiol. 2017,  174, 124–153.  40. Wang, P.; Luo, Q.; Yang, W.C.; Ahammed, G.J.; Ding, S.T.; Chen, X.Y.; Wang, J.; Xia, X.J.; Shi, K. A Novel Role of Pipecolic Acid  Biosynthetic Pathway in Drought Tolerance through the Antioxidant System in Tomato. Antioxidants 2021, 10, 1923.  41. Herrmann, K.M. The Shikimate Pathway as An Entry to Aromatic Secondary Metabolism. Plant Physiol. 1995, 107, 7–12.  42. Passarinho, J.A.P.; Lamosa, P.; Baeta, J.P.; Santos, H.; Ricardo, C.P.P. Annual changes in the concentration of minerals and or‐ ganic compounds of Quercus suber leaves. Physiol. Plant. 2006, 127, 100–110.  43. Aranda, I.; Cadahia, E.; Fernandez de Simon, B. Specific leaf metabolic changes that underlie adjustment of osmotic potential  in response to drought by four Quercus species. Tree Physiol. 2021, 41, 728–743.  44. Zhang, J.; Su, Y.; Li, J.; Ren, Z.; Tian, G.; Wang, J. Untargeted GC‐TOFMS Analysis Reveals Metabolomic Changes in Salvia  miltiorrhiza Bunge Leaf and Root in Response to Long‐Term Drought Stress. Horticulturae 2021, 7, 175.  45. Rahmati, M.; Vercambre, G.; Davarynejad, G.; Bannayan, M.; Azizi, M.; Genard, M. Water scarcity conditions affect peach fruit  size and polyphenol contents more severely than other fruit quality traits. J. Sci. Food Agric. 2015, 95, 1055–1065.  46. Li, P.‐C.; Yang, X.‐Y.; Wang, H.‐M.; Pan, T.; Yang, J.‐Y.; Wang, Y.‐Y.; Xu, Y.; Yang, Z.‐F.; Xu, C.‐W. Metabolic responses to com‐ bined water deficit and salt stress in maize primary roots. J. Integr. Agric. 2021, 20, 109–119.  47. Roberts, M.R. Does GABA Act as a Signal in Plants? Hints from Molecular Studies. Plant Signal Behav. 2007, 2, 408–409.  48. Hasan, M.M.; Alabdallah, N.M.; Alharbi, B.M.; Waseem, M.; Yao, G.; Liu, X.D.; Abd El‐Gawad, H.G.; El‐Yazied, A.A.; Ibrahim,  M.F.M.; Jahan, M.S.; et al. GABA: A Key Player in Drought Stress Resistance in Plants. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10136.  49. Bown, A.W.; Shelp, B.J. Plant GABA: Not Just a Metabolite. Trends Plant Sci. 2016, 21, 811–813.  50. Xu, B.; Long, Y.; Feng, X.; Zhu, X.; Sai, N.; Chirkova, L.; Betts, A.; Herrmann, J.; Edwards, E.J.; Okamoto, M.; et al. GABA signal‐ ling modulates stomatal opening to enhance plant water use efficiency and drought resilience. Nat. Commun. 2021, 12, 1–13.  51. Yong, B.; Xie, H.; Li, Z.; Li, Y.‐P.; Zhang, Y.; Nie, G.; Zhang, X.‐Q.; Ma, X.; Huang, L.‐K.; Yan, Y.‐H.; et al. Exogenous Application  of GABA Improves PEG‐Induced Drought Tolerance Positively Associated with GABA‐Shunt, Polyamines, and Proline Metab‐ olism in White Clover. Front. Physiol. 2017, 8, 1107.  52. Tang, M.; Li, Z.; Luo, L.; Cheng, B.; Zhang, Y.; Zeng, W.; Peng, Y. Nitric Oxide Signal, Nitrogen Metabolism, and Water Balance  Affected by gamma‐Aminobutyric Acid (GABA) in Relation to Enhanced Tolerance to Water Stress in Creeping Bentgrass. Int.  J. Mol. Sci. 2020, 21, 7460.  53. Abd El‐Gawad, H.G.; Mukherjee, S.; Farag, R.; Abd Elbar, O.H.; Hikal, M.; Abou El‐Yazied, A.; Abd Elhady, S.A.; Helal, N.;  ElKelish, A.; El Nahhas, N.; et al. Exogenous gamma‐aminobutyric acid (GABA)‐induced signaling events and field perfor‐ mance associated with mitigation of drought stress in Phaseolus vulgaris L. Plant Signal. Behav. 2021, 16, 1853384.  54. Zhang, P.; Fan, Y.; Sun, X.; Chen, L.; Terzaghi, W.; Bucher, E.; Li, L.; Dai, M. A large‐scale circular RNA profiling reveals universal  maize and Arabidopsis. Plant J. 2019, 98, 697–713.  molecular mechanisms responsive to drought stress in  55. Yuan, Y.; Ren, S.; Liu, X.; Su, L.; Wu, Y.; Zhang, W.; Li, Y.; Jiang, Y.; Wang, H.; Fu, R.; et al. SlWRKY35 positively regulates  carotenoid biosynthesis by activating the MEP pathway in tomato fruit. New Phytol. 2022, 234, 164–178.    Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 5947  18  of  18  56. Chen, W.; Gong, L.; Guo, Z.L.; Wang, W.S.; Zhang, H.Y.; Liu, X.Q.; Yu, S.B.; Xiong, L.Z.; Luo, J. A Novel Integrated Method for  Large‐Scale  Detection,  Identification,  and  Quantification  of  Widely  Targeted  Metabolites: Application  in  the  Study  of  Rice  Metabolomics. Mol. Plant 2013, 6, 1769–1780.  57. Kanehisa, M.; Goto, S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 27–30.  58. Bylesjo, M.; Rantalainen, M.; Cloarec, O.; Nicholson, J.K.; Holmes, E.; Trygg, J. OPLS discriminant analysis: Combining the  strengths of PLS‐DA and SIMCA classification. J. Chemom. 2006, 20, 341–351.  59. Chen, C.; Chen, H.; Zhang, Y.; Thomas, H.R.; Frank, M.H.; He, Y.; Xia, R. TBtools: An Integrative Toolkit Developed for Inter‐ active Analyses of Big Biological Data. Mol. Plant 2020, 13, 1194–1202. 

Journal

International Journal of Molecular Sciences – Multidisciplinary Digital Publishing Institute

Published: May 25, 2022

Keywords: Chinese cabbage; drought stress; metabolome; abscisic acid; glutathione

There are no references for this article.