Get 20M+ Full-Text Papers For Less Than $1.50/day. Start a 14-Day Trial for You or Your Team.

Learn More →

Techniques for Haploid and Doubled Haploid Production

Techniques for Haploid and Doubled Haploid Production TECHNIQUES FOR HAPLOID AND DOUBLED HAPLOID PRODUCTION Haploids are plants (sporophytes) that contain a gametic chromomosome number (n). They rarely occur spontaneously in nature but several techniques are nowadays available for their production. Induction and regeneration of haploids (doubled haploids) enables the production of completely homozygous lines in one generation, thus shortening this process by many years. They are broadly used in breeding programs of plant species for which efficient protocols have been developed, such as barley, wheat, maize, tobacco, onion, cucumber, rapeseed and other Brassica species. This article presents the main characteristics of haploids, doubled haploids and inducing techniques, with an emphasis on their role in plant breeding. Key words: Gynogenesis, androgenesis, microspore, homozygosity, heterozygosity, irradiated pollen, plant tissue culture, ploidy level 1 UVOD Danes obsega zlahtnjenje rastlin poleg tradicionalnih tehnik kot so selekcija, nacrtna medsortna in medvrstna krizanja ter inducirane mutacije, tudi sodobnejse - biotehnoloske - metode med katere spadajo in vitro vzgoja zdravih rastlin, resevanje nedozorelih embrijev tezavnih krizanj, in vitro oprasevanje, fuzija protoplastov, in vitro mutageneza, poliploidizacija, genske transformacije in proizvodnja podvojenih haploidnih rastlin. Haploidi in podvojeni haploidi (DH) so se v zlahtnjenju rastlin zaceli uporabljati v drugi polovici prejsnjega stoletja pri koruzi (Forster in sod., 2007) in se sedaj uporabljajo za zlahtnjenje stevilnih kmetijskih rastlin. V zadnjih letih se je raziskovanje indukcije haploidov (in DH) razsirilo iz zit in zelenjadnic na okrasne (Bal in Touraev, 2009; Ferrie in Caswell, 2011; Murovec in Bohanec, 2013), aromaticne in zdravilne rastline (Ferrie, 2009) in zato je pricakovati, da se bo dr., Univerza v Ljubljani, Biotehniska fakulteta, Katedra za genetiko, biotehnologijo, statistiko in zlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana, Slovenija, e-naslov: jana.murovec@bf.uni-lj.si str. 293 - 307 kmalu njihova uporaba razsirila tudi na te ekonomsko manj pomembne vrste. Prednost zlahtnjenja rastlin z uporabo tehnik indukcije haploidov je v hitrejsi proizvodnji popolnoma homozigotnih rastlin, ki se pri tujeprasnicah uporabljajo kot starsevske linije za pridobivanje hibridov, pri samoprasnicah pa ze predstavljajo komercialno linijo. Zaradi enkratnega nastanka popolne homozigotnosti, se takoj izrazijo vsi skodljivi recesivni geni, ki bi pri samooprasevanju povzrocali inbriding depresijo. Tako indukcija haploidov sluzi tudi kot selekcijski pritisk proti skodljivim recesivnim genom. Zlahtnjenje se kakor pri klasicnih metodah zacne z izborom in krizanjem starsevskih rastlin in se nadaljuje z indukcijo haploidov iz razlicnih generacij, kakor je prikazano na sliki 1. Zlahtnitelji najpogosteje pridobivajo haploidne linije iz F1 generacije, katerih gamete predstavljajo F2 generacijo. Kljub temu mnogi priporocajo kasnejsi pricetek pridobivanje haploidnih linij (iz F2 donorskih rastlin), saj je na ta nacin omogocena se ena mejotska preureditev kromosomov in s tem vecja variabilnost. Nekateri zlahtnitelji se celo odlocajo za haploidizacijo sele po nekaj letih selekcije in samooprasevanja na polju in s podvojenimi haploidi le stabilizirajo najbolj perspektivne linije. Pridobivanje haploidov iz poliploidnih rastlin (npr. iz tetraploidnega krompirja) omogoca njihovo krizanje z diploidnimi divjimi sorodnimi vrstami, s tem prenos zanimivih genov med vrstami in zlahtnjenje na diploidnem nivoju. Pri zlahtnjenju s pomocjo induciranja mutacij na haploidem nivoju je hitrejse in lazje odkrivanje recesivnih sprememb, saj se le-te zaradi homozigotnosti izrazijo takoj in tudi vsakrsna mutacija se takoj fiksira v genom. Haploidni protoplasti so idealno orodje za studij genetike somatskih celic, aplikacijo indukcije mutacij (veliko stevilo individualnih genotipov, odsotnost himernosti, izrazenost mutiranih genov), za fuzijo protoplastov (nastanek alodiploidnih organizmov namesto alotetraploidnih), prenos DNK (takojsnje izrazanje vkljucenih genov in s tem povezana hitrejsa selekcija). Zaradi popolne homozigotnosti in z njo povezane moznosti veckratnega spolnega razmnozevanja preko semen brez segregacije v naslednjih generacijah, so podvojeni haploidi zelo primerni tudi za mapiranje genov in genomske studije. Zaradi popolne homozigotnosti, se v zadnjih letih haploidi uporabljajo tudi za sekvenciranje celotnih genomov kot na primer pri Citrus clementina Hort. ex Tan. (Aleza in sod., 2009). 294 Slika 1: Primerjava pridobivanja homozigotnih linij s samooprasevanjem (levo) in s postopki indukcije haploidov (desno). Stevilke prikazujejo pricakovane odstotke homozigotnosti posameznih generacij. Figure 1: Comparison between self-pollination (left) and doubled haploid induction for production of homozygous lines. The numbers represent the expected homozygosity of each generation. 2 TEHNIKE INDUKCIJE IN REGENERACIJE HAPLOIDOV (in PODVOJENIH HAPLOIDOV) Haploidi so samostojne rastline (sporofiti) z gametnim (haploidnim) stevilom kromosomov. Od odkritja prvega spontanega haploida vrste Datura stramonium L. leta 1922 pa do danes, so razvili postopke indukcije haploidov za vec kot 250 rastlinskih vrst (Maluszynski in sod., 2003). Najbolj uspesni in siroko uporabljeni so protokoli indukcije haploidov pri jecmenu (Hordeum vulgare L.), psenici (Triticum aestivum L.), oljni ogrscici (Brassica napus L.), tobaku (Nicotiana tabacum L.) in koruzi (Zea mays L.). Pri teh rastlinskih vrstah intenzivno preucujejo tudi gene odgovorne za prehod iz gametofitnega v sporofitni razvoj mikrospor (Hosp in sod., 2007; SeguiSimarro in Nuez, 2008). Na uspeh indukcije haploidov vplivajo: genotip in starost maticnih rastlin, rastne razmere in pred-tretiranje maticnih rastlin (temperatura, osvetlitev), razvojna faza gamet, pred-tretiranje gamet (temperaturni in/ali osmotski sok, stradanje mikrospor, obsevanje z gama zarki) pH in sestava gojisca (predvsem dodani rastni regulatorji), temperatura, osvetlitev in fotoperioda v rastni komori. Haploidi nastali iz diploidnih rastlin vsebujejo samo eno garnituro kromosomov, so monoploidi (2n=1x), medtem ko jih haploidi nastali iz poliploidnih vrst vsebujejo vec. Tako na primer haploid iz tetraploidnega (2n=4x) krompirja vsebuje dve kromosomski garnituri (2n=2x) in ga imenujemo dihaploid. Po istem principu je haploid iz heksaploidnega (2n=6x) kivija triploid (2n=3x) in vsebuje tri garniture kromosomov. Dihaploidi, trihaploidi itd. zaradi vecjega stevila kromosomskih garnitur niso homozigotni. Pogosto se izraz dihaploid napacno uporablja tako v slovenski kakor v tuji literaturi za oznacevanje podvojenih haploidov. Le-ti so popolnoma homozigotne diploidne rastline, ki nastanejo iz haploidov po podvajanju stevila kromosomov. So koncni cilj in uporabni produkt vseh tehnik indukcij haploidov in se kot taki uporabljajo pri zlahtnjenju rastlin in genetskih studijah. Med postopki androgeneze in ginogeneze lahko pride tudi do spontanega podvajanja kromosomov in se zato poleg haploidov regenerira tudi dolocen delez spontanih DH. Pojav je pogost pri androgenezi, kjer je delez spontanih DH do 90 % (Maluszynski in sod., 2003) in ga povzroca predvsem fuzija jeder (Sunderland, 1974; Kasha in sod., 2001; Testillano in Risueno, 2009). Med in vitro ginogenezo in po razlicnem oprasevanju je spontano podvajanje kromosomov redek pojav in ne presega 10-15 % (Maluszynski in sod., 2003). Najvisji delez spontanih DH med in vitro ginogenezo so Alan in sodelavci (2004) odkrili pri cebuli (15 %). Nizek odstotek induciranih in regeneriranih haploidov oz. DH, odvisnost uspeha od genotipa maticnih rastlin in s tem povezane omejitve pri prenosu tehnik iz modelnih genotipov v komercialno zanimive sorte, ter tezavnost podvajanja kromosomov haploidov, se vedno predstavljajo dolocene ovire pri uporabi DH v zlahtnjenju rastlin, kjer je potrebna hitra proizvodnja fertilnih DH iz vseh zanimivih krizancev. Haploide lahko pridobivamo iz moskih gamet (t.i. androgeneza) s pomocjo kulture prasnic ali kulture izoliranih mikrospor in iz zenskih gamet. Nastanek haploidov iz zenskih gamet lahko sprozimo in vitro (ginogeneza) ali in situ z razlicnimi vrstami oprasevanja. 2.1 In vitro indukcija haploidov (ginogeneza) Znacilnost in vitro ginogeneze je kultura neoprasenih socvetij, cvetov, plodnic ali njihovih delov na primernem hranilnem gojiscu, ki ob ugodnih fizikalnih pogojih sprozi nastanek haploidnih rastlin. Za to je v vecini primerov potrebna inokulacija nezrelih zenskih gametofitov (Musial in sod., 2001; Gémes-Juhász in sod., 2002), ki, za razliko od mikrospor, v tkivni kulturi dozorijo (Musial in sod., 2005). Vecinoma se haploidi regenerirajo iz jajcnih celic (Ferrant in Bouharmont, 1994; Musial in sod., 2005; Thomas, 2004). Pri vecini rastlinskih vrst je metoda manj uspesna od androgeneze, predvsem zaradi majhnega stevila semenskih zasnov (potencialnih haploidnih embrijev) na cvet in nizkih odstotkov uspeha. Poleg tega je tudi odstotek spontano podvojenih haploidov bistveno nizji kakor pri androgenezi. Zaradi nastetega se in vitro ginogeneza raziskuje predvsem pri vrstah, kjer androgeneza ni bila uspesna, kot so cebula (Bohanec in Jakse, 1999; Alan in sod., 2004), sladkorna pesa (Ferrant in Bouharmont, 1994) in drugih vrstah (Bohanec, 2009). Ginogeneza je edina moznost pridobivanja haploidov iz mosko sterilnih linij in zenskih klonov dvodomnih zenskih rastlin. V zlahtnjenju se metoda in vitro ginogeneze uporablja pri vrstah Gerbera jamesonii H. Bolus, Allium sp., Beta sp. (Wedzony in sod., 2009) in kumarah (ustni vir). 296 2.2 In situ indukcija haploidov 2.2.1 Medvrstno oprasevanje In situ indukcijo haploidov iz zenskih gamet lahko sprozi oprasevanje s pelodom sorodne ali nesorodne vrste (rodu) po katerem pride do oploditve jajcne celice in naknadno, v zgodnji embriogenezi, do izlocanja kromosomov oprasevalca. Kromosomi oprasevalca se pogosto izlocijo tudi iz endosperma, zaradi cesar le-ta ne omogoca normalne rasti in razvoja embrija. V izogib propadu embrijev jih je v takih primerih potrebno nekaj dni po oprasevanju resiti z gojenjem in vitro. Metodo so odkrili pri krizanju jecmena Hordeum vulgare L. z divjo sorodno vrsto H. bulbosum L. (Kasha in Kao, 1970). Zaradi slabse razvitosti endosperma je 12-15 dni po oprasevanju potrebno resevanje embrijev in njihovo gojenje in vitro. Tako imenovana bulbosum metoda je se vedno zelo ucinkovita metoda pridobivanja haploidov pri jecmenu (Devaux in Kasha, 2009), s katero so pozlahtnili ze preko 60 sort (Thomas in sod., 2003). Je edina metoda indukcije haploidov pri jecmenu, katere uspeh ni odvisen od genotipa in je uspesna tudi pri kultivarjih, kjer androgeneza ni. Oprasevanje s H. bulbosum je uspesno sprozilo nastanek haploidnih embrijev tudi pri posameznih genotipih psenice in tritikale, vendar zaradi inkombatibilnosti metoda ni sirse uporabna za druga zita. Podoben nacin z oploditvijo in naknadnim izlocanjem kromosomov oprasevalca deluje po oprasevanju jecmena s pelodom koruze. Uspesno indukcijo haploidov so tako dosegli se pri oprasevanju psenice (Triticum aestivum L.) (Laurie in Bennett, 1988), jecmena (Furusho, 1991, cit. po Wedzony in sod., 2009), tritikale (x Triticosecale) (Wedzony, 2003), ovsa (Avena sativa L.) (Rines, 2003) in rzi (Secale cereale L.) (Deimling in Fleihinghaus-Roux, 1996). Tudi pri krompirju (Solanum tuberosum L., 2n=4x) medvrstno oprasevanje s S. phurea (2n=2x) povzroca nastanek embrijev z gametnim stevilom kromosomov. Ker je krompir v osnovi tetraploiden, so nastali embriji dihaploidni (2n=2x), saj vsebujejo dve garnituri kromosomov, in niso homozigotni. Princip delovanja temelji na lastnosti dolocenih genotipov S. phurea pri katerih obe spermalni jedri v pelodnem mesicku oplodita polarni jedri embrionalne vrecke. Tako nastane 6x endosperm, ki omogoca rast in razvoj 2x embrija. Ceprav je odstotek semen z dihaploidnimi embriji relativno nizek, jih je mogoce hitro in enostavno odbrati zaradi homozigotnega dominantnega markerja za vijolicne pege semen, ki jih vsebujejo IVP genotipi S. phurea (Maine, 2003). Indukcija haploidov z medvrstnim oprasevanjem je bila uspesna tudi pri citrusih, saj je po in vitro oprasevanju diploidne vrste Citrus clementina Hort. Ex Tan. cv. Nules s pelodom triploidne grenivke Oroblanco uspela regeneriracija 14 haploidov (Germanà in Chiancone, 2001). 2.2.2 Oprasevanje znotraj oprasevalnimi ('inducer') obsevanim pelodom vrste linijami z ali Poznani sta dve vrsti in situ indukcije haploidov iz zenskih gamet, ki temeljita na oprasevanju s pelodom iste vrste. Prva metoda je poznana pri koruzi, pri kateri so odkrili oprasevalno ('inducer') linijo 'Stock 6', ki je po oprasevanju sprozila nastanek do 2,3 % spontanih haploidov (Coe, 1959, cit. po Bohanec, 1994). Linijo so krizali s stevilnimi drugimi linijami in krizance uporabili za oprasevanje z namenom pridobivanja haploidov. Porocajo, da s sodobnimi oprasevalnimi linijami dosegajo ze 8-10 % uspeh (Geiger in Gordillo, 2009; Melchinger in sod., 2013). Tako kot pri krompirju, tudi pri oprasevanju s koruzo oprasevalne linije vsebujejo homozigotni dominantni morfoloski marker (za vijolicno barvo embrija in alevrona) s pomocjo katerega lahko locijo haploidne od hibridnih embrijev. Poleg tega ni potrebno in vitro resevanje embrijev, saj semena s haploidnimi embriji vsebujejo normalen endosperm. Oboje olajsa indukcijo haploidov in povecuje uporabnost tehnike za zlahtnjenje rastlin, saj omogoca izlocanje hibridov brez dodatnih laboratorijskih analiz (Zhang in sod., 2008). V raziskavi Barreta in sodelavcev (2008) so odkrili ggi1 lokus na kromosomu 1, ki je odgovoren za izlocanje kromosomov oprasevalca. Druga moznost in situ ginogeneze z oprasevanjem znotraj vrste je oprasevanje z obsevanim pelodom. Metoda je bila uspesna pri stevilnih rastlinskih vrstah, kar prikazuje preglednica 1. Preglednica 1: Seznam rastlinskih vrst in virov pri katerih so z oprasevanjem z obsevanim pelodom spodbudili nastanek haploidnih rastlin. Table 1: List of plant species and available publications about haploid induction protocols by pollination with irradiated pollen. Vrsta Viri buce Kurtar in sod., 2002, 2009; Kurtar and Balkaya, 2010; Kosmrlj in sod., 2013 cebula Dore in Marie, 1993 crni ribez Naess in sod., 1998 divja cesnja Höfer in Grafe, 2003 hruska Bouvier in sod., 1993 jablana Zhang in Lespinasse, 1991; De Witte in Keulemans, 1994; Hofer in Lespinasse, 1996 kivi Pandey in sod., 1990; Chalak in Legave, 1997; Musial in Przywara, 1998, 1999 kumara Przyborowski in Niemirowicz-Szczytt, 1994; Faris in sod., 1999; Faris in Niemirowicz-Szczytt, 1999; Claveria in sod., 2005 lubenica Sari in sod., 1994 mandarina Froelicher in sod., 2007; Aleza in sod., 2009 melona Sauton in Dumas de Vaulx, 1987; Cuny in sod., 1993; Katoh in sod., 1993; Lotfi in sod., 2003; Gonzalo in sod., 2011; Godbole in Murthy, 2012 nagelj Sato in sod., 2000 oreh Grouh in sod., 2011 krinkar Murovec in sod., 2013 petunija Raquin, 1985 pomelo Yahata in sod., 2010 sliva Peixe in sod., 2000 soncnica Todorova in sod., 1997 Nicotiana Pandey, 1980; Pandey in Phung, 1982 vrtnica Meynet in sod., 1994 298 Metoda temelji na lastnosti peloda obsevanega z UV, ali X zarki, ki po oprasevanju na brazdi normalno kali in pelodni mesicek napreduje skozi vrat pestica do embrionalne vrecke, kjer se tvori embrij. Ali jedri peloda oplodita jajcno celico in polarni jedri in se kromosomi oprasevalca izlocijo sele v kasnejsi embriogenezi ali pa nastanek haploidnega embrija sprozi ze sama kalitev peloda, je za enkrat se nedoreceno. Novejse raziskave nakazujejo na moznost, da do oploditve dejansko pride, vendar se kromosomi iz mocno obsevanega peloda cez cas izlocijo iz jedra (Murovec in Bohanec, 2013). Uspeh metode je, poleg dejavnikov nastetih v drugem poglavju tega prispevka, odvisen od doze obsevanja in razvojne faze embrijev ob resevanju. Vpliv doze sevanja na prezivetje haploidnih embrijev in krizancev je prvi preucil Hertwig leta 1911 v svojih poskusih oplojevanja jajcnih celic zab. Po njem so kasneje pojav poimenovali 'Hertwigov efekt'. V svojih poskusih je opazil, da po oprasevanju s spermalnimi celicami predhodno obsevanimi z nizkimi dozami, velik odstotek embrijev propade zgodaj v razvoju. Tisti, ki prezivijo, pa kazejo razlicne morfoloske spremembe. Oprasevanje s spermalnimi celicami obsevanimi z visokimi dozami, povzroci visji odstotek zivih embrijev, ki so normalnega fenotipa (Hertwig, 1912 cit. po Pandey in Phung, 1982). Kasneje so pojav temeljito preucili in ugotovili, da so mocno obsevane spermalne celice zmozne prodreti v jajcno celico, vendar je niso zmozne oploditi. Kljub temu pa stimulirajo delitev jajcne celice in ginogenetski razvoj embrija. Pri nizjih dozah obsevanja, spermalne celice obdrzijo sposobnost oploditve jajcne celice, vendar zaradi obsevanja na hibrida prenesejo mutacije, ki povzrocajo nenormalen fenotip ali prezgodnjo smrt (razlicni avtorji, cit. po Pandey in Phung, 1982). Pandey in Phung (1982) sta 'Hertwigov efekt' prva opazila pri rastlinah med oprasevanjem stirih vrst rodu Nicotiana. Pri nizjih dozah obsevanja (100200 Gy) je z visanjem doze padal odstotek pridobljenih sejancev, od katerih jih je veliko kmalu po kalitvi propadlo. Sejanci, ki so preziveli do cvetenja, so bili morfolosko razlicni, niso bili podobni materinim rastlinam in so bili vecinoma sterilni. Citoloske analize so pokazale, da so bile rastline aneuploidni krizanci, ki so vsebovali vse kromosome materine rastline in razlicno stevilo kromosomov od oprasevalne rastline. Z visanjem doze obsevanja peloda nad 500 Gy, se je stevilo aneuploidov manjsalo, vecalo pa se je stevilo dihaploidov in podvojenih dihaploidov. Kasneje so vpliv doze sevanja na izid oprasevanja preucevali se pri drugih kmetijsko pomembnih rastlinskih vrstah. Tako so tudi pri kumarah (Claveria in sod., 2005), kiviju (Chalak in Legave, 1997; Musial in Przywara, 1998) in orehu (Grouh in sod., 2011), z visanjem doze obsevanja, uspeli regenerirati vecje stevilo haploidov v primerjavi z nizjimi dozami. Po drugi strani pa visanje doze mocno vpliva na manjsanje stevila nastalih plodov (Przyborowski in Niemirowicz-Szczytt, 1994; Kurtar in sod., 2002; Froelicher in sod., 2007; Kosmrlj in sod., 2013), manjsanje stevila normalno razvitih semen (Cuny in sod., 1993; Przyborowski in NiemirowiczSzczytt, 1994; Chalak in Legave, 1997; Musial in Przywara, 1998; Sugiyama in Morishita, 2000; Lotfi in sod., 2003; Froelicher in sod., 2007), manjso kalivost semen (Chalak in Legave, 1997) in na manjse stevilo nastalih embrijev (Grouh in sod., 2011; Kosmrlj in sod., 2013). Oprasevanje z obsevanim pelodom je najbolj raziskano pri bucevkah (druzina Cucurbitaceae) pri katerih se metoda uporablja ze vrsto let v zlahtniteljskih programih (Sugiyama in Morishita, 2000; Sari in Yetisir, 2002; Kuzuya in sod., 2003; Claveria in sod., 2005). Od prvih poskusov leta 1987 (Sauton in Dumas de Valux, 1987) pa do danes, so s pomocjo oprasevanja z obsevanim pelodom, pridobili haploide pri melonah, lubenicah, kumarah in razlicnih bucah. Metoda temelji na oprasevanju z obsevanim pelodom in kasnejsim resevanjem embrijev na E20A gojiscu, ki sta ga uporabila ze Sauton in Dumas de Valux leta 1987 pri melonah. Resevanje embrijev poteka 3-5 tednov po oprasevanju, ko se iz polnih semen izolira embrije. Ob izolaciji so embriji v razlicnih razvojnih fazah: pri bucah so od tockaste do kotiledonske faze (Kurtar in sod., 2002), pri kumarah so od zgodnje srcaste do kotiledonske faze (Faris in sod., 1999) in pri melonah so od globularne do kotiledonske faze (Cuny in sod., 1993). Kurtar in sodelovci (2002) so dokazali, da je uspesnost regeneracije rastlin odvisna od razvojne stopnje embrijev ob resevanju. Najvisji odstotek regeneracije so dosegli iz embrijev inokuliranih v kotiledonski fazi. Kasneje so opazili, da je z razvojno fazo ob resevanju povezana tudi ploidnost embrijev. Embriji v zgodnejsih fazah razvoja so bili haploidni, medtem ko so bili embriji v kotiledonski fazi izkljucno diploidni. Rezultati so skladni z rezultati Faris in Niemirowicz-Szczytt (1999), ki sta spremljala razvoj embrijev in endospermov kumare po oprasevanju s svezim pelodom in pelodom obsevanim pri 100 ali 300 Gy. Ugotovila sta, da se v primerjavi s kontrolnim oprasevanjem, embriji in endospermi nastali po oprasevanju z obsevanim pelodom, razvijajo pocasneje in kazejo odstopanja od normalne morfologije. Poleg tega so, po oprasevanju z obsevanim pelodom, embriji v kasnejsih razvojnih fazah (mutanti) zaceli propadati ze 9 (100 Gy) oz. 3 dan (300 Gy) po oprasevanju, tako da sta 15 dni po oprasevanju v semenskih zasnovah zasledila samo se embrije v globularni razvojni fazi. Velika prednost indukcije haploidov s pomocjo oprasevanja z obsevanim pelodom je, da pri nekaterih vrstah kot so kivi (Pandey in sod., 1990; Chalak in Legave, 1997), cebula (Dore in Marie, 1993), mandarina (Froelicher in sod., 2007) in vrste rodu Nicotiana (Pandey in Phung, 1982) ni potrebe po resevanju embrijev. Tako pri kiviju puscajo oprasene cvetove na trsih do fizioloske zrelosti plodov, jih nato vernalizirajo in izlocijo semena. Pandey in sodelavci (1990) so slabso in vivo kalivost zrelih partenogenetskih semen izbojsali z in vitro kalitvijo semen na stirih razlicnih hranilnih gojiscih, Chalak in Legave (1997) pa sta kasneje kalitev semen poenostavila in dobila zadovoljiv odstotek trihaploidnih regenerantov tudi po neposredni setvi v vermikulit. Spontana diploidizacija haploidnega jedra po oprasevanju z obsevanim pelodom je bila na podlagi morfoloskega opazovanja regenerantov opazena pri vrstah rodu Nicotiana (Pandey in Phung, 1982), cebuli (Dore in Marie, 1993), soncnici (Todorova in sod., 1997), nageljnu (Sato in sod., 2000) in meloni (Lotfi in sod., 2003). Pri soncnicah so opazili zanimiv pojav spontane diploidizacije haploidov med gojenjem v rastlinjaku. Od 296 regenerantov, katerim so s pretocno citometrijo opravljeno v fazi 2-3 listov dokazali haploidnost, so po 20 dneh rasti v rastlinjaku dobili 239 (81 %) diploidov, 32 (11 %) miksoploidov in le preostalih 25 (8 %) je ostalo haploidnih (Todorova in sod., 1997). Spontano podvojene haploide so samooprasili, linije odbrali glede na lastnosti zanimive za zlahtnjenje in 17 odbranih DH linij analizirali s 4 izoencimskimi 300 markerji. Rastline znotraj vseh linij so bile uniformne, linije pa so bile homozigotne in so vsebovale izoencime materinih ali ocetovskih rastlin. 2.3 Androgeneza S pojmom androgeneza (ali embriogeneza mikrospor) oznacujemo pridobivanje haploidnih embrijev iz moskih gamet. Poznani sta dve metodi in sicer in vitro kultura prasnic, s katero so pred 50 leti pridobili prve haploide (vrsta Datura innoxia; Guha in Maheshwari, 1964, 1966) in kultura izoliranih mikrospor, ki je sledila 10 let kasneje (tobak; Nitsch, 1974). Zaradi velike uspesnosti in uporabnosti pri stevilnih rastlinskih vrstah, je androgeneza najbolj pogosto uporabljena metoda indukcije haploidov pri zlahtnjenju rastlin in genetskih raziskavah. V komercialne namene se redno uporablja pri jecmenu, psenici, koruzi, rizu, tritikali, rzi, tobaku, oljni ogrscici in drugih vrstah rodu Brassica (podrobni protokoli so zbrani v Maluszynski in sod., 2003). Glavne slabosti androgeneze so mocna odvisnost uspeha od genotipa rastline, neodzivnost dolocenih kmetijsko pomembnih vrst (drevesne vrste, strocnice) in modelne rastline Arabidopsis thaliana ter relativno velik delez regeneriranih albino rastlin. Metoda temelji na sposobnosti nezrelega peloda ­ mikrospor, da ob primernih drazljajih, spremeni razvojno pot iz gametofitne (dozorevanja peloda) v sporofitno (nastanek embrija). Ob ugodnih pogojih v in vitro razmerah, nastane haploidni embrij neposredno ali pa posredno preko kulture haploidnega kalusa. Androgeneza iz prasnic je najbolj preprosta metoda pri kateri se po povrsinski sterilizaciji predtretiranih cvetnih brstov, prasnice asepticno izlocijo in gojijo na hranilnih gojiscih. Kultura izoliranih mikrospor se zacne podobno, le da se izolirane prasnice potopi v tekoce gojisce, kjer se ob stalnem tresenju izlocijo mikrospore. Druga moznost izolacije mikrospor je trenje steriliziranih cvetnih brstov v tekocem gojiscu in kasnejse locevanje mikrospor od somatskega tkiva s filtriranjem in centrifugiranjem. Ceprav je izolacija mikrospor bolj zahtevna metoda, je njena velika prednost locevanje mikrospor od sporofitnega tkiva. Tako je onemogocen vpliv sporofitnega tkiva na embriogenezo mikrospor in hkrati se prepreci nevarnost regeneracije heterozigotov iz somatskih celic. Za uspesno spremembo razvojne poti iz gametofitnega v sporofitni razvoj, je najpomembnejsi dejavnik razvojna faza mikrospor. Za vecino rastlinskih vrst je najbolj primeren cas prve haploidne mitoze, ko so mikrospore v pozni enojedrni in zgodnji dvojedrni fazi (Touraev in sod., 1997; Maraschin in sod., 2005). Stresni dejavniki, ki se uporabljajo v ta namen (temperaturno pred-tretiranje, stradanje mikrospor in osmotski stres), se razlikujejo glede na rastlinsko vrsto. Tako se pri jecmenu, psenici, koruzi, rizu, tritikali in rzi uporablja pred-tretiranje na nizkih temperatureh, pri vrstah rodu Brassica in tobaku pa na visokih temperaturah, oboje vec ur ali dni. Pri oljni ogrscici in tobaku so dokazali, da lahko embriogenezo sprozijo razlicni stresni dejavniki, odvisno od razvojne faze mikrospor. Tako za enojedrne mikrospore oljne ogrscice zadostuje temperatura 32 ºC, za dvojedrne pa je potrebna ze temperatura 41 ºC (Maraschin in sod., 2005). Pri tobaku, temperaturni sok uspesno vodi v embriogenezo enocelicne mikrospore, medtem ko dvojedrnih mikrospor ne in jih je potrebno izpostaviti stradanju (Touraev in sod., 1997). 3 DOLOCANJE PLOIDNOSTI IN PREVERJANJE HOMOZIGOTNOSTI REGENERANTOV Med in vitro kulturo cvetov in njihovih delov (prasnice, plodnice, itd.) se lahko na hranilnih gojiscih regenerirajo poleg haploidnih tudi diploidne rastline in celo rastline visjih stopenj ploidnosti (Sunderland, 1974; Germanà 2005, 2006, 2009; Kosmrlj in sod., 2013; Murovec in Bohanec, 2013). V preteklosti so za dolocanje ploidnosti uporabljali posredne metode kot so spremljanje morfoloskih lastnosti rastlin (velikost rastlin in listov, oblika cvetov), fertilnosti rastlin, bujnost rastlin, stevilo kloroplastov v celicah zapiralkah in velikost listnih rez. Metode so bile zamudne, nenatancne in pod vplivom nepredvidljivih okoljskih dejavnikov. Dandanes se uporabljajo predvsem citoloske tehnike stetja metafaznih kromosomov (primer protokola je predstavljen v Maluszynska, 2003) in merjenje kolicine DNA v jedrih s pomocjo pretocne citometrije (primer protokola je predstavljen v Bohanec, 2003). Slednja metoda predstavlja najhitrejso in najbolj zanesljivo tehniko dolocanja ploidnosti regenerantov. Omogoca zelo zgodnje dolocanje, saj za analizo zadostujejo ze majhne kolicine rastlinskega materiala, tako da se analiza lahko opravi se v fazi tkivne kulture. Poleg tega je s pomocjo pretocne citometrije mogoce odkrivanje miksoploidnih regenerantov, kar z ostalimi tehnikami ni mogoce. Diploidni regeneranti so lahko posledica spontane diploidizacije gamet (so spontani podvojeni haploidi), somatski regeneranti iz diploidnih starsevskih celic ali krizanci po samooprasevanju oz. tujeoprasevanju. Zato je za dokoncno potrditev DH potrebna analiza homozigotnosti. V ta namen se uporabljajo stevilne metode, odvisno od rastlinske vrste in dostopnih markerskih sistemov. V preteklosti je analiza diploidnih regenerantov temeljila predvsem na fenotipskih markerjih (Raquin, 1985; Dore in Marie, 1993; De Witte in Keulemans, 1994; Maine, 2003) ter na samooprasevanju pridobljenih regenerantov in morfoloskem testiranju potomstva (Sato in sod., 2000). Potomci DH naj bi bili izenaceni za vse lastnosti in pri njih naj ne bi bilo opaziti segregacije lastnosti. Kasneje so se uveljavili stevilni molekulski markerji, med njimi sprva izoencimi (Campion s sod., 1995; Bohanec in Jakse, 1999; Germanà in Chiancone, 2001; Höfer in Grafe, 2003), kasneje pa se DNA molekulski markerji kot npr. AFLP (Eeckhaut s sod., 2001) in RAPD (Bohanec in sod., 1995; Eimert in sod., 2003; Yahata in sod., 2005 a, b). Zaradi kodominantnega nacina dedovanja, relativne pogostosti v genomu evkariontov, visoke stopnje polimorfizma, preprostega in nedvoumnega vrednotenja (PCR namnozevanje, dolocanje dolzine z avtomatskimi sekvencnimi aparati), mikrosateliti v zadnjih letih nadomescajo ostale metode preverjanja homozigotnosti regenerantov. V primerih indukcije haploidov z inokulacijo prasnic ali drugih delov ne-oprasenih cvetov, je za potrditev DH dovolj analiza enega mikrosatelitnega lokusa, ki je pri izvorni rastlini heterozigoten. Pri indukciji haploidov s pomocjo oprasevanja, kjer obstaja moznost nenamerne samooploditve ali oploditve s strani oprasevalca, pa je potrebno analizirati vec lokusov. Tako so Kosmrlj in sodelavci (2013) odkrili, da je za nedvoumno potrditev izvora diploidnih regenerantov buc v vecini primerov zadostna analiza na treh lokusih. Mikrosatelite so uporabili za dolocanje genetskega izvora diploidov pri stevilnih rastlinskih vrstah kot so Citrus clementina (Germanà in Chiancone, 2003; Germanà in sod., 2005), jablana (Höfer in sod., 2002; Vanwynsberghe in sod., 2005), hruska (Bouvier in sod., 2002), psenica (Muranty in sod., 2002), koruza (Aulinger in sod., 2003; Tang in sod., 2006), mandarina (Froelicher in sod., 2007), oranzni krinkar (Murovec in Bohanec, 2013) in oljne buce (Kosmrlj in sod., 2013). Za hitro in poceni locevanje med haploidi in nezazeljenimi heterozigotnimi diploidi po indukciji z oprasevanjem, so najbolj primerni morfoloski znaki, ki se izrazijo zgodaj v razvoju. Tako pri koruzi poznajo gen R1-nj, ki ob prisotnosti dominantnih genov A1 ali A2 in C2 povzroci rdece obarvanje alevronske plasti endosperma in v predelu skuteluma ­ scitka (Geiger in Gordillo, 2009). Gen R1-nj mora biti v materini rastlini homozigotno recesiven, v oprasevalni liniji pa homozigotno dominanten. Po oprasevanju, se selekcija opravi ze med zrnjem, saj se pri zrnju z nezazelenimi hibridnimi embriji opazi rdece obarvano krono v predelu alevronske plasti endosperma in skuteluma, zrnje s haploidnim embrijem pa vsebuje rdeco krono samo v alevronski plasti zaradi normalne oploditve polarnih jeder. Nedavno so predstavili nov morfoloski znak, ki naj bi v prihodnje sluzil za locevanje haploidov od krizancev koruze. S krizanjem so ustvarili dve novi oprasevalni liniji z izredno visoko vsebnostjo olja, hibridne potomce pa so dolocili s pomocjo jedrne magnetne resonance (nuclear magnetic resonance, NMR), saj so vsebovali vecjo vsebnost olja od haploidnih (Melchinger in sod., 2013). Glavna prednost predstavljene novitete je v veliki zanesljivosti in moznosti avtomatizacije, hitrost pa je trenutno 20 semen na minuto. Podoben princip z barvnim morfoloskim znakom uporabljajo tudi pri krompirju, po oprasevanju s S. phurea. Dominantni gen povzroca vijolicaste pike na semenih in vijolicen obroc v predelu nodija stebla, tako da lahko selekcija poteka v dveh razvojnih fazah. Tako pri koruzi kakor pri krompirju pa opisana barvna morfoloska znaka ne moreta lociti haploidnih embrijev od hibridov po nenamernem samooprasevanju, zato so potrebni se dodatni morfoloski ali molekulski markerji. 4 PODVAJANJE STEVILA KROMOSOMOV Haploidi zaradi enojnega stevila kromosomov ne tvorijo funkcionalnih gamet (so sterilni) in je za pridobivanje fertilnih linij potrebno stevilo njihovih kromosomov podvojiti. Za pridobivanje t.i. podvojenih haploidov (doubled haploids, DH), homozigotnih na vseh lokusih, se uporabljajo razlicne tehnike, ki vecinoma vkljucujejo tretiranje z antimitoticnimi sredstvi kot so kolhicin (v zacetku izoliran iz jesenskega podleska Colchicum autumnale L.), orizalin, trifluralin, amiprofos-metil (AMP) in drugi. Ta sredstva se lahko uporabijo v razlicnih fazah indukcije haploidov od najzgodnejse faze mikrospor, ko jih dodajajo v indukcijsko gojisce, pa vse do faze aklimatiziranih haploidnih rastlin, pri katerih se sredstva nanasajo na meristeme. Novejse raziskave nakazujejo moznost podvajanja kromosomov preko adventivne regeneracije (Maine, 2003; Skof in sod., 2007) brez uporabe antimitoticnih sredstev. Tako so pri salotki na gojiscu za indukcijo 302 ginogeneze opazili spontano podvajanje kromosomov somatskih regenerantov, v tem primeru iz diploidnega v tetraploidno stevilo (Sulistyaningsih in sod., 2006). Metodo so uspesno uporabili za podvajanje kromosomov haploidnih rastlin cebule Alan in sodelavci (2007), ki so s somatsko regeneracijo na gojiscih za indukcijo ginogeneze pridobili 61 % diploidnih regenerantov. Odstotek regeneriranih diploidov se je ob dodajanju 12,5, 25 ali 50 M kolhicina v gojisce celo zmanjsal, ob hkratnem povecanju odstotka regeneriranih tetraploidov in miksoploidov. S somatsko regeneracijo so iz miksoploidnega maticnega materiala uspeli regenerirati same diploide. Se boljse rezultate so dosegli Jakse in sodelavci (2010) s somatsko regeneracijo iz kulture cvetnih brstov, kjer so dobili do 83 % uspesnost podvajanja kromosomov haploidnih in do 100 % uspesnost podvajanja kromosomov miksoploidnih cebul. 5 ZAKLJUCEK Petdeset let od prvega sprozenega nastanka haploidnih rastlin so tehnike indukcije in regeneracije haploidov se vedno oz. vedno bolj aktualne. Od prvotne uporabe v zlahtnjenju najpomembnejsih poljscin, se njihovo pridobivanje siri na druge vrste kot so zelenjadnice, okrasne, zdravilne, aromaticne in krmne rastline. Poleg tega dobivajo (podvojeni) haploidi z novimi tehnologijami (npr. dolocanje zaporedij celotnih genomov) nov pomen in vlogo v sodobnih genetskih studijah. Zato menim, da bodo haploidi in podvojeni haploidi tudi v prihodnje igrali pomembno vlogo v kmetijstvu in bazicnih raziskavah. 6 VIRI Alan A.R., Brants A., Cobb E., Goldschmied P.A., Mutschler M.A., Earle E.D. 2004. Fecund gynogenic lines from onion (Allium cepa L.) breeding materials. Plant Science, 167, 5: 10551066 Alan A.R., Lim W., Mutschler M.A., Earle E.D. 2007. Complementary strategies for ploidy manipulations in gynogenic onion (Allium cepa L.). Plant Science, 173: 25-31 Aleza P., Juarez J., Hernandez M., Pina J.A., Ollitrault P., Navarro L. 2009. Recovery and characterization of a Citrus clementina Hort. ex Tan. 'Clemenules' haploid plant selected to establish the reference whole Citrus genome sequence. BMC Plant Biology, 9, st. clanka 110 Aulinger I.E., Peter S.O., Schmid J.E., Stamp P. 2003. Rapid attainment of a doubled haploid line from transgenic maize (Zea mays L.) plants by means of anther culture. In Vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 39: 165-170 Bal U., Touraev A. 2009. Microspore embryogenesis in selected medicinal and ornamental species of the Asteraceae. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 219-229 Barret P., Brinkmann M., Beckert M. 2008. A major locus expressed in the male gametophyte with incomplete penetrance is responsible for in situ gynogenesis in maize. Theoretical and Applied Genetics, 117: 581-594 Bohanec B. 1994. Induction of gynogenesis in agricultural crops: a review. V: Proceedings of the international colloquium on impact of plant biotechnology on agriculture, December 5th - 7th 1994, Rogla, Slovenia. Javornik B., Bohanec B., Kreft I. (ur.). Ljubljana, Biotechnical Faculty, Agronomy Department, Centre for Plant Biotechnology and Breeding: 43-55 Bohanec B. 2003. Ploidy determination using flow cytometry. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 397-403 Bohanec B. 2009. Doubled haploids via gynogenesis. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 35-46 Bohanec B. Jakse M., Ihan A., Javornik B., 1995. Studies of gynogenesis in onion (Allium cepa L.): induction procedures and genetic analysis of regenerants. Plant Science, 104: 215-224 Bohanec B., Jakse M. 1999. Variations in gynogenic response among long-day onion (Allium cepa L.) accessions. Plant Cell Reports, 18: 737-742 Bouvier L., Guérif P., Djulbic M., Durel C.E., Chevreau E., Lespinasse Y. 2002. Chromosome doubling of pear haploid plants and homozygosity assessment using isozyme and microsatellite markers. Euphytica, 123: 255-262 Bouvier L., Zhang Y.X., Lespinasse Y. 1993. Two methods of haploidization in pear, Pyrus communis L.: greenhouse seedling selection and in situ parthenogenesis induced by irradiated pollen. Theoretical and Applied Genetics, 87: 229-232 Campion B., Bohanec B., Javornik B. 1995. Gynogenic lines of onion (Allium cepa L.): evidence of their homozygosity. Theoretical and Applied Genetics, 91: 598-602 Chalak L., Legave J.M. 1997. Effects of pollination by irradiated pollen in Hayward kiwifruit and spontaneous doubling of induced parthenogenetic trihaploids. Scientia Horticulturae, 68: 83-93 Claveria E., Garcia-Mas J., Dolcet-Sanjuan R. 2005. Optimization of cucumber doubled haploid line production using in vitro rescue of in vivo induced 303 parthenogenic embryos. Journal of the American Society for Horticultural Science, 130, 4: 555-560 Cuny F., Grotte M., Dumas de Vaulx R., Rieu A. 1993. Effects of gamma irradiation of pollen on parthenogenetic haploid production in muskmelon (Cucumis melo L.). Environmental and Experimental Botany, 33, 2: 301-312 De Witte K., Keulemans J. 1994. Restrictions of the efficiency of haploid plant production in apple cultivar Idared, through parthenogenesis in situ. Euphytica, 77: 141-146 Deimling S., Fleihinghaus-Roux T. 1996. Haploids in rye. V: In vitro haploid production in higher plants. Jain S.M., Spory S.K., Veilleux R.E. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 181-204 Devaux P., Kasha K.J. 2009. Overview of barley doubled haploid production. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 47-63 Dore C., Marie F. 1993. Production of gynogenetic plants of onion (Allium cepa L.) after crossing with irradiated pollen. Plant Breeding, 111: 142-147 Eeckhaut T., Werbrouck S., Dendauw J., Bockstaele E.V., Dobergh P. 2001. Induction of homozygous Spathiphyllum wallisii genotypes through gynogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 67:181-189 Eimert K., Reutter G., Strolka B. 2003. Fast and reliable detection of doubled-haploids in Asparagus officinalis by stringent RAPD-PCR. Journal of Agricultural Science, 141: 73-78 Faris N.M., Niemirowicz-Szczytt K. 1999. Cucumber (Cucumis sativus L.) embryo development in situ after pollination with irradiated pollen. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 41: 111118 Faris N.M., Nikolova V., Niemirowicz-Szczytt K. 1999. The effect of gamma irradiation dose on cucumber (Cucumis sativus L.) haploid embryo production. Acta Physiologiae Plantarum, 21, 4: 391-396 Ferrant V., Bouharmont J. 1994. Origin of gynogenetic embryos of Beta vulgaris L. Sexual Plant Reproduction, 7: 12-16 Ferrie A.M.R. 2009. Current status of doubled haploids in medicinal plants. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 209-217 Ferrie A.M.R., Caswell K.L. 2011. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 104, 3: 301-309 304 Forster B.P., Heberle-Bors E., Kasha K.J., Touraev A. 2007. The resurgence of haploids in higher plants. Trends in Plant Science, 368-375 Froelicher Y., Bassene J.B., Jedidi-Neji E., Dambier D., Morillon R., Bernardini G., Costantino G., Ollitrault P. 2007. Induced parthenogenesis in mandarin for haploid production: induction procedures and genetic analysis of plantlets. Plant Cell Reports, 26:937-944 Geiger H.H., Gordillo G.A. 2009. Doubled haploids in hybrid maize breeding. Maydica, 54: 485-499 Gémes-Juhász A., Baloh P., Ferenczy A., Kristf Z. 2002. Effect of optimal stage of female gametophyte and heat treatment on in vitro gynogenesis induction in cucumber (Cucumis sativus L.). Plant Cell Reports, 21: 105-111 Germanà M.A. 2006. Doubled haploid production in fruit crops. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 86: 131­146 Germanà M.A. 2009. Haploid and doubled haploids in fruit trees. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 241­263 Germanà M.A., Chiancone B, Lain O., Testolin R. 2005. Anther culture in Citrus clementina: a way to regenerate tri-haploids. Australian Journal of Agricultural Research, 56: 839-845 Germanà M.A., Chiancone B. 2001. Gynogenetic haploids of Citrus after in vitro pollination with triploid pollen grains. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 66: 59-66 Germanà M.A., Chiancone B. 2003. Improvement of Citrus clementina Hort. Ex Tan. microsporederived embryoid induction and regeneration. Plant Cell Reports, 22: 181-187 Godbole M., Murthy H.N. 2012. Parthenogenetic haploid plants using gamma irradiated pollen in snapmelon (Cucumis melo var. momordica). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 109: 167-170 Gonzalo M.J., Claveria E., Monforte A.J., DolcetSanjuan R. 2011. Parthenogenic haploids in melon: Generation and molecular characterization of a doubled haploid line population. Journal of the American Society for Horticultural Science, 136: 145-154 Grouh M. S.H., Vahdati K., Lotfi M., Hassani D., Biranvand N. P. 2011. Production of haploids in persian walnut through parthenogenesis induced by gamma-irradiated pollen. Journal of the American Society for Horticultural Science, 136, 3: 198­204 Guha S., Maheshwari S.C. 1964. In vitro production of embryos from anthers of Datura. Nature, 204, 4957: 497 Guha S., Maheshwari, S.C. 1966. Cell division and differentiation of embryos in the pollen grains of Datura in vitro. Nature, 212: 97-98 Höfer M., Gomez A., Aguiriano E., Manzanera J.A., Bueno M.A. 2002. Analysis of simple sequence repeat markers in homozygous lines of apple. Plant Breeding, 121: 159-16 Höfer M., Grafe Ch. 2003. Induction of doubled haploids in sweet cherry (Prunus avium L.). Euphytica, 130: 191-197 Höfer M., Lespinasse Y. 1996. Haploidy in apple. V: In vitro haploid production in higher plants, Vol. 3: Important selected plants. Jain S.M., Sopory S.K., Veilleux R.E. (ur). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 261-276 Hosp J., Maraschin S.F., Touraev A., Boutilier K. 2007. Functional genomics of microspore embryogenesis. Euphytica, 158: 275-285 Jakse M., Hirschegger P., Bohanec B., Havey M.J. 2010. Evaluation of gynogenic responsiveness and pollen viability of selfed doubled haploid onion lines and chromosome doubling via somatic regeneration. Journal of the American Society for Horticultural Science, 135, 1: 67-73 Kasha K.J., Hu T.C., Oro R., Simion E., Shim Y.S. 2001. Nuclear fusion leads to chromosome doubling during mannitol pretreatment of barley (Hordeum vulgare L.) microspores. Journal of Experimental Botany, 52, 359: 1227-1238 Kasha K.J., Kao K.N. 1970. High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature, 225: 874-876 Katoh N., Hagimori M., Iwai S. 1993. Production of haploid plants of melon by pseudofertilized ovule culture. Plant Tissue Culture Letters, 10: 60-66 Kosmrlj K., Murovec, J., Bohanec B. 2013. Haploid induction in hull-less seed pumpkin through parthenogenesis induced by X-ray-irradiated pollen. Journal of the American Society for Horticultural Science, 138: 310-316 Kurtar E.S., Balkaya A. 2010. Production of in vitro haploid plants from in situ induced haploid embryos in winter squash (Cucurbita maxima Duchesne ex Lam.) via irradiated pollen. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture, 102: 267­277 Kurtar E.S., Balkaya A., Ozbakir M., Ofluoglu T. 2009. Induction of haploid embryo and plant regeneration via irradiated pollen technique in pumpkin (Cucurbita moschata Duchesne ex. Poir). African Journal of Biotechnology, 8: 5944­5951 Kurtar E.S., Sari N., Abak K. 2002. Obtention of haploid embryos and plants through irradiated pollen technique in squash (Cucurbita pepo L.). Euphytica, 127: 335-344 Kuzuya M., Hosoya K., Yashiro K. Tomita K., Ezura H. 2003. Powdery mildew (Sphaerotheca fuliginea) resistance in melon is selectable at the haploid level. Journal of Experimental Botany, 54, 384: 1069-1074 Laurie D.A., Bennett M.D. 1988. The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses. Theoretical and Applied Genetics, 76: 393-397 Lotfi M., Alan A.R., Henning M.J., Jahn M.M., Earle E.D. 2003. Production of haploid and doubled haploid plants of melon (Cucumis melo L.) for use in breeding for multiple virus resistance. Plant Cell Reports, 21: 1121-1128 Maine M.J. 2003. Potato haploid technologies. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 241-247 Maluszynska J. 2003. Cytogenetic tests for ploidy level analyses ­ chromosome counting. V: Doubled haploid production in crop plants: A manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 391-395 Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. 2003. Doubled haploid production in crop plants, a manual. Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 428 str. Maraschin S.F., de Priester W., Spaink H.P., Wang M. 2005. Androgenic switch: an example of plant embryogenesis from the male gametophyte perspective. Journal of Experimental Botany, 56, 417: 1711-1726 Melchinger A.E., Schipprack W., Würschum T., Chen S., Technow F. 2013. Rapid and accurate identification of in vivo-induced haploid seeds based on oil content in maize. Scientific Reports, 3, st. clanka 2129 Meynet J., Barrade R., Duclos A., Siadous R. 1994. Dihaploid plants of roses (Rosa x hybrida, cv 'Sonia') obtained by parthenogenesis induced using irradiated pollen and in vitro culture of immature seeds. Agronomie, 2: 169-175 Muranty H., Sourdille P., Bernard S., Bernard M. 2002. Genetic characterization of spontaneous diploid androgenetic wheat and triticale plants. Plant Breeding, 121: 470-474 Murovec J., Bohanec B. 2013. Haploid induction in Mimulus aurantiacus Curtis obtained by pollination with gamma irradiated pollen. Scientia Horticulturae, 162: 218-225 Musial K., Bohanec B., Jakse M., Przywara L. 2005. The development of onion (Allium cepa L.) embryo sacs in vitro and gynogenesis induction in relation to flower size. In vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 41: 446-452 Musial K., Bohanec B., Przywara L. 2001. Embryological study on gynogenesis in onion (Allium cepa L.). Sexual Plant Reproduction, 13: 335-341 Musial K., Przywara L. 1998. Influence of irradiated pollen on embryo and endosperm development in kiwifruit. Annals of Botany, 82: 747-756 Musial K., Przywara L. 1999. Pollination with heavily irradiated pollen in Nicotiana: induced parthenogenesis and embryological study. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 41: 127137 Naess S.K., Swartz H.J., Bauchan G.R. 1998. Ploidy reduction in blackberry. Euphytica, 99: 57-73 Nitsch C, 1974. Pollen culture - a new technique for mass production of haploid and homozygous plants. V: Haploids in higher plants: advances and potential : proceedings of the first international symposium, Guelph, Ontario, Canada. Kasha K.J. (ur). University of Guelph: 123­135 Pandey K.K. 1980. Parthenogenetic diploidy and egg transformation induced by irradiated pollen in Nicotiana. New Zeland Journal of Botany, 18, 2: 203-207 Pandey K.K., Phung M. 1982. 'Hertwig effect in plants: induced parthenogenesis through the use of irradiated pollen. Theoretical and Applied Genetics, 62: 295-300 Pandey K.K., Przywara L., Sanders P.M. 1990. Induced parthenogenesis in kiwifruit (Actinidia deliciosa) through the use of lethally irradiated pollen. Euphytica, 51: 1-9 Peixe A., Campos M.D., Cavaleiro C., Barroso J., Pais M.S. 2000. Gamma-irradiated pollen induces the formation of 2n endosperm and abnormal embryo development in Euroean plum (Prunus domestica L., cv. `Rainha Claudia Verde'. Scientia Horticulturae, 86, 4: 267-278 Przyborowski J., Niemirowicz-Szczytt K. 1994. Main factors affecting cucumber (Cucumis sativus L.) 306 haploid embryo development and haploid plant characteristics. Plant Breeding, 112: 70-75 Raquin C. 1985. Induction of haploid plants by in vitro culture of Petunia ovaries pollinated with irradiated pollen. Zeitschrift für Pflanzenzüchtung, 94: 166169 Rines H.W. 2003. Oat haploid from wide hybridization. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 155-159 Sari N., Abak K., Pitrat M., Rode J.C., Dumas de Vaulx R. 1994. Induction of parthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen in watermelon. HortScience, 29, 10: 1189-1190 Sari N., Yetisir H. 2002. Some agronomical characteristics of doubled haploid lines produced by irradiated pollen technique and parental diploid genotypes in melons. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 26: 311-317 Sato S., Katoh N., Yoshida H., Iwai S., Hagimori M. 2000. Production of doubled haploid plants of carnation (Dianthus caryophyllus L.) by pseudofertilized ovule culture. Scientia Horticulturae, 83: 301-310 Sauton A., Dumas De Vaulx R. 1987. Obtention de plantes haploides chez le melon (Cucumis melo L.) par gynogenese induite par pollen irradie. Agronomie, 7, 2: 141­148 Segui-Simarro J., Nuez F. 2008. How microspores transform into haploid embryos: changes addociated with embryogenesis induction and microspore-derived embryogenesis. Physiologia Plantarum, 134: 1-12 Sugiyama K., Morishita M. 2000. Production of seedless watermelon using soft-X-irradiated pollen. Scientia Horticulturae, 84: 255-264 Sulistyaningsih E., Aoyagi Y., Tashiro Y. 2006. Flower bud culture of shallot (Allium cepa L. Aggregatum group) with cytogenetic analysis of resulting gynogenic plants and somaclones. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 86: 249-255 Sunderland N. 1974. Anther culture as a means of haploid production. V: Haploids in higher plants: advances and potential : proceedings of the first international symposium, Guelph, Ontario, Canada. Kasha K.J. (ur). University of Guelph: 91-122 Skof S., Bohanec B., Kastelec D., Luthar Z. 2007. Spontaneous induction of tetraploidy in hop using adventitious shoot regeneration method. Plant Breeding, 126, 4: 416-421 Tang F., Tao Y., Zhao T., Wang G. 2006. In vitro production of haploid and doubled haploid plants from pollinated ovaries of maize (Zea mays L.). Plant Cell Tissue Organ Culture, 84: 233-237 Testillano P.S., Risueno M.C. 2009. Tracking gene and protein expression during microspore embryogenesis by confocal laser scanning microscopy. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 339-347 Thomas T.D. 2004. Embryological observations on unpollinated ovary culture of mulberry (Morus alba L.). Acta Biologica Cracovensia Series Botanica, 46: 87-94 Thomas W.T.B., Forster B.P., Gertsson B. 2003. Doubled haploids in breeding. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 337-349 Todorova M., Ivanov P., Shindrova P., Christov M., Ivanova I. 1997. Doubled haploid production of sunflower (Helianthus annuus L.) through irradiated pollen-induced parthenogenesis. Euphytica, 97: 249-254 Touraev A., Stoger E., Voronin V., Heberle-Bors E. 1997. Plant male germ line transformation. Plant Journal, 12, 4: 949-956 Vanwynsberghe L., De Witte K., Coart E., Keulemans J. 2005. Limited application of homozygous genotypes in apple breeding. Plant Breeding, 124: 399-403 Wedzony M. 2003. Protocol for doubled haploid production in hexaploid triticale (xTriticosecale Wittm.) by crosses with maize. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 135-140 Wedzony M., Forster B.P., Zur I., Golemiec E., Szechynske-Hebda M., Dubas E., Gotebiowska G. 2009. Progress in doubled haploid technology in higher plants. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 1-33 Yahata M., Harusaki S., Komatsu H., Takami K., Kunitake H., Yabuya T., Yamashita K., Toolapong P. 2005a. Morphological characterization and molecular verification of a fertile haploid pummelo (Citrus grandis Osbeck). Journal of the American Society for Horticultural Science, 130: 34-40 Yahata M., Kunitake H., Yabuya T., Yamashita K., Kashihara Y., Komatsu H. 2005b. Production of a doubled haploid from a haploid pummelo using colchicine treatment of axillary shoot buds. Journal of the American Society for Horticultural Science. 130: 899-903 Yahata M., Yasuda K., Nagasawa K., Harusaki S., Komatsu H., Kunitake H. 2010. Production of haploid plant of `Banpeiyu' pummelo (Citrus maxima (Burm.) Merr.) by pollination with soft xray-irradiated pollen. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 79: 239-245 Zhang Y.X., Lespinasse Y. 1991. Pollination with gamma-irradiated pollen and development of fruits, seeds and parthenogenetic plants in apple. Euphytica, 54: 101-109 Zhang Z.L., Qiu F.Z., Liu Y.Z., Ma K.J., Li Z.Y., Xu S.Z. 2008. Chromosome elimination and in vivo haploid production induced by Stock 6-derived inducer line in maize (Zea mays L.). Plant Cell Reports, 27, 12: 1851-1860 http://www.deepdyve.com/assets/images/DeepDyve-Logo-lg.png Acta Agriculturae Slovenica de Gruyter

Techniques for Haploid and Doubled Haploid Production

Acta Agriculturae Slovenica , Volume 101 (2) – Sep 1, 2013

Loading next page...
 
/lp/de-gruyter/techniques-for-haploid-and-doubled-haploid-production-FA2WO0u2sl
Publisher
de Gruyter
Copyright
Copyright © 2013 by the
ISSN
1581-9175
eISSN
1854-1941
DOI
10.2478/acas-2013-0025
Publisher site
See Article on Publisher Site

Abstract

TECHNIQUES FOR HAPLOID AND DOUBLED HAPLOID PRODUCTION Haploids are plants (sporophytes) that contain a gametic chromomosome number (n). They rarely occur spontaneously in nature but several techniques are nowadays available for their production. Induction and regeneration of haploids (doubled haploids) enables the production of completely homozygous lines in one generation, thus shortening this process by many years. They are broadly used in breeding programs of plant species for which efficient protocols have been developed, such as barley, wheat, maize, tobacco, onion, cucumber, rapeseed and other Brassica species. This article presents the main characteristics of haploids, doubled haploids and inducing techniques, with an emphasis on their role in plant breeding. Key words: Gynogenesis, androgenesis, microspore, homozygosity, heterozygosity, irradiated pollen, plant tissue culture, ploidy level 1 UVOD Danes obsega zlahtnjenje rastlin poleg tradicionalnih tehnik kot so selekcija, nacrtna medsortna in medvrstna krizanja ter inducirane mutacije, tudi sodobnejse - biotehnoloske - metode med katere spadajo in vitro vzgoja zdravih rastlin, resevanje nedozorelih embrijev tezavnih krizanj, in vitro oprasevanje, fuzija protoplastov, in vitro mutageneza, poliploidizacija, genske transformacije in proizvodnja podvojenih haploidnih rastlin. Haploidi in podvojeni haploidi (DH) so se v zlahtnjenju rastlin zaceli uporabljati v drugi polovici prejsnjega stoletja pri koruzi (Forster in sod., 2007) in se sedaj uporabljajo za zlahtnjenje stevilnih kmetijskih rastlin. V zadnjih letih se je raziskovanje indukcije haploidov (in DH) razsirilo iz zit in zelenjadnic na okrasne (Bal in Touraev, 2009; Ferrie in Caswell, 2011; Murovec in Bohanec, 2013), aromaticne in zdravilne rastline (Ferrie, 2009) in zato je pricakovati, da se bo dr., Univerza v Ljubljani, Biotehniska fakulteta, Katedra za genetiko, biotehnologijo, statistiko in zlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana, Slovenija, e-naslov: jana.murovec@bf.uni-lj.si str. 293 - 307 kmalu njihova uporaba razsirila tudi na te ekonomsko manj pomembne vrste. Prednost zlahtnjenja rastlin z uporabo tehnik indukcije haploidov je v hitrejsi proizvodnji popolnoma homozigotnih rastlin, ki se pri tujeprasnicah uporabljajo kot starsevske linije za pridobivanje hibridov, pri samoprasnicah pa ze predstavljajo komercialno linijo. Zaradi enkratnega nastanka popolne homozigotnosti, se takoj izrazijo vsi skodljivi recesivni geni, ki bi pri samooprasevanju povzrocali inbriding depresijo. Tako indukcija haploidov sluzi tudi kot selekcijski pritisk proti skodljivim recesivnim genom. Zlahtnjenje se kakor pri klasicnih metodah zacne z izborom in krizanjem starsevskih rastlin in se nadaljuje z indukcijo haploidov iz razlicnih generacij, kakor je prikazano na sliki 1. Zlahtnitelji najpogosteje pridobivajo haploidne linije iz F1 generacije, katerih gamete predstavljajo F2 generacijo. Kljub temu mnogi priporocajo kasnejsi pricetek pridobivanje haploidnih linij (iz F2 donorskih rastlin), saj je na ta nacin omogocena se ena mejotska preureditev kromosomov in s tem vecja variabilnost. Nekateri zlahtnitelji se celo odlocajo za haploidizacijo sele po nekaj letih selekcije in samooprasevanja na polju in s podvojenimi haploidi le stabilizirajo najbolj perspektivne linije. Pridobivanje haploidov iz poliploidnih rastlin (npr. iz tetraploidnega krompirja) omogoca njihovo krizanje z diploidnimi divjimi sorodnimi vrstami, s tem prenos zanimivih genov med vrstami in zlahtnjenje na diploidnem nivoju. Pri zlahtnjenju s pomocjo induciranja mutacij na haploidem nivoju je hitrejse in lazje odkrivanje recesivnih sprememb, saj se le-te zaradi homozigotnosti izrazijo takoj in tudi vsakrsna mutacija se takoj fiksira v genom. Haploidni protoplasti so idealno orodje za studij genetike somatskih celic, aplikacijo indukcije mutacij (veliko stevilo individualnih genotipov, odsotnost himernosti, izrazenost mutiranih genov), za fuzijo protoplastov (nastanek alodiploidnih organizmov namesto alotetraploidnih), prenos DNK (takojsnje izrazanje vkljucenih genov in s tem povezana hitrejsa selekcija). Zaradi popolne homozigotnosti in z njo povezane moznosti veckratnega spolnega razmnozevanja preko semen brez segregacije v naslednjih generacijah, so podvojeni haploidi zelo primerni tudi za mapiranje genov in genomske studije. Zaradi popolne homozigotnosti, se v zadnjih letih haploidi uporabljajo tudi za sekvenciranje celotnih genomov kot na primer pri Citrus clementina Hort. ex Tan. (Aleza in sod., 2009). 294 Slika 1: Primerjava pridobivanja homozigotnih linij s samooprasevanjem (levo) in s postopki indukcije haploidov (desno). Stevilke prikazujejo pricakovane odstotke homozigotnosti posameznih generacij. Figure 1: Comparison between self-pollination (left) and doubled haploid induction for production of homozygous lines. The numbers represent the expected homozygosity of each generation. 2 TEHNIKE INDUKCIJE IN REGENERACIJE HAPLOIDOV (in PODVOJENIH HAPLOIDOV) Haploidi so samostojne rastline (sporofiti) z gametnim (haploidnim) stevilom kromosomov. Od odkritja prvega spontanega haploida vrste Datura stramonium L. leta 1922 pa do danes, so razvili postopke indukcije haploidov za vec kot 250 rastlinskih vrst (Maluszynski in sod., 2003). Najbolj uspesni in siroko uporabljeni so protokoli indukcije haploidov pri jecmenu (Hordeum vulgare L.), psenici (Triticum aestivum L.), oljni ogrscici (Brassica napus L.), tobaku (Nicotiana tabacum L.) in koruzi (Zea mays L.). Pri teh rastlinskih vrstah intenzivno preucujejo tudi gene odgovorne za prehod iz gametofitnega v sporofitni razvoj mikrospor (Hosp in sod., 2007; SeguiSimarro in Nuez, 2008). Na uspeh indukcije haploidov vplivajo: genotip in starost maticnih rastlin, rastne razmere in pred-tretiranje maticnih rastlin (temperatura, osvetlitev), razvojna faza gamet, pred-tretiranje gamet (temperaturni in/ali osmotski sok, stradanje mikrospor, obsevanje z gama zarki) pH in sestava gojisca (predvsem dodani rastni regulatorji), temperatura, osvetlitev in fotoperioda v rastni komori. Haploidi nastali iz diploidnih rastlin vsebujejo samo eno garnituro kromosomov, so monoploidi (2n=1x), medtem ko jih haploidi nastali iz poliploidnih vrst vsebujejo vec. Tako na primer haploid iz tetraploidnega (2n=4x) krompirja vsebuje dve kromosomski garnituri (2n=2x) in ga imenujemo dihaploid. Po istem principu je haploid iz heksaploidnega (2n=6x) kivija triploid (2n=3x) in vsebuje tri garniture kromosomov. Dihaploidi, trihaploidi itd. zaradi vecjega stevila kromosomskih garnitur niso homozigotni. Pogosto se izraz dihaploid napacno uporablja tako v slovenski kakor v tuji literaturi za oznacevanje podvojenih haploidov. Le-ti so popolnoma homozigotne diploidne rastline, ki nastanejo iz haploidov po podvajanju stevila kromosomov. So koncni cilj in uporabni produkt vseh tehnik indukcij haploidov in se kot taki uporabljajo pri zlahtnjenju rastlin in genetskih studijah. Med postopki androgeneze in ginogeneze lahko pride tudi do spontanega podvajanja kromosomov in se zato poleg haploidov regenerira tudi dolocen delez spontanih DH. Pojav je pogost pri androgenezi, kjer je delez spontanih DH do 90 % (Maluszynski in sod., 2003) in ga povzroca predvsem fuzija jeder (Sunderland, 1974; Kasha in sod., 2001; Testillano in Risueno, 2009). Med in vitro ginogenezo in po razlicnem oprasevanju je spontano podvajanje kromosomov redek pojav in ne presega 10-15 % (Maluszynski in sod., 2003). Najvisji delez spontanih DH med in vitro ginogenezo so Alan in sodelavci (2004) odkrili pri cebuli (15 %). Nizek odstotek induciranih in regeneriranih haploidov oz. DH, odvisnost uspeha od genotipa maticnih rastlin in s tem povezane omejitve pri prenosu tehnik iz modelnih genotipov v komercialno zanimive sorte, ter tezavnost podvajanja kromosomov haploidov, se vedno predstavljajo dolocene ovire pri uporabi DH v zlahtnjenju rastlin, kjer je potrebna hitra proizvodnja fertilnih DH iz vseh zanimivih krizancev. Haploide lahko pridobivamo iz moskih gamet (t.i. androgeneza) s pomocjo kulture prasnic ali kulture izoliranih mikrospor in iz zenskih gamet. Nastanek haploidov iz zenskih gamet lahko sprozimo in vitro (ginogeneza) ali in situ z razlicnimi vrstami oprasevanja. 2.1 In vitro indukcija haploidov (ginogeneza) Znacilnost in vitro ginogeneze je kultura neoprasenih socvetij, cvetov, plodnic ali njihovih delov na primernem hranilnem gojiscu, ki ob ugodnih fizikalnih pogojih sprozi nastanek haploidnih rastlin. Za to je v vecini primerov potrebna inokulacija nezrelih zenskih gametofitov (Musial in sod., 2001; Gémes-Juhász in sod., 2002), ki, za razliko od mikrospor, v tkivni kulturi dozorijo (Musial in sod., 2005). Vecinoma se haploidi regenerirajo iz jajcnih celic (Ferrant in Bouharmont, 1994; Musial in sod., 2005; Thomas, 2004). Pri vecini rastlinskih vrst je metoda manj uspesna od androgeneze, predvsem zaradi majhnega stevila semenskih zasnov (potencialnih haploidnih embrijev) na cvet in nizkih odstotkov uspeha. Poleg tega je tudi odstotek spontano podvojenih haploidov bistveno nizji kakor pri androgenezi. Zaradi nastetega se in vitro ginogeneza raziskuje predvsem pri vrstah, kjer androgeneza ni bila uspesna, kot so cebula (Bohanec in Jakse, 1999; Alan in sod., 2004), sladkorna pesa (Ferrant in Bouharmont, 1994) in drugih vrstah (Bohanec, 2009). Ginogeneza je edina moznost pridobivanja haploidov iz mosko sterilnih linij in zenskih klonov dvodomnih zenskih rastlin. V zlahtnjenju se metoda in vitro ginogeneze uporablja pri vrstah Gerbera jamesonii H. Bolus, Allium sp., Beta sp. (Wedzony in sod., 2009) in kumarah (ustni vir). 296 2.2 In situ indukcija haploidov 2.2.1 Medvrstno oprasevanje In situ indukcijo haploidov iz zenskih gamet lahko sprozi oprasevanje s pelodom sorodne ali nesorodne vrste (rodu) po katerem pride do oploditve jajcne celice in naknadno, v zgodnji embriogenezi, do izlocanja kromosomov oprasevalca. Kromosomi oprasevalca se pogosto izlocijo tudi iz endosperma, zaradi cesar le-ta ne omogoca normalne rasti in razvoja embrija. V izogib propadu embrijev jih je v takih primerih potrebno nekaj dni po oprasevanju resiti z gojenjem in vitro. Metodo so odkrili pri krizanju jecmena Hordeum vulgare L. z divjo sorodno vrsto H. bulbosum L. (Kasha in Kao, 1970). Zaradi slabse razvitosti endosperma je 12-15 dni po oprasevanju potrebno resevanje embrijev in njihovo gojenje in vitro. Tako imenovana bulbosum metoda je se vedno zelo ucinkovita metoda pridobivanja haploidov pri jecmenu (Devaux in Kasha, 2009), s katero so pozlahtnili ze preko 60 sort (Thomas in sod., 2003). Je edina metoda indukcije haploidov pri jecmenu, katere uspeh ni odvisen od genotipa in je uspesna tudi pri kultivarjih, kjer androgeneza ni. Oprasevanje s H. bulbosum je uspesno sprozilo nastanek haploidnih embrijev tudi pri posameznih genotipih psenice in tritikale, vendar zaradi inkombatibilnosti metoda ni sirse uporabna za druga zita. Podoben nacin z oploditvijo in naknadnim izlocanjem kromosomov oprasevalca deluje po oprasevanju jecmena s pelodom koruze. Uspesno indukcijo haploidov so tako dosegli se pri oprasevanju psenice (Triticum aestivum L.) (Laurie in Bennett, 1988), jecmena (Furusho, 1991, cit. po Wedzony in sod., 2009), tritikale (x Triticosecale) (Wedzony, 2003), ovsa (Avena sativa L.) (Rines, 2003) in rzi (Secale cereale L.) (Deimling in Fleihinghaus-Roux, 1996). Tudi pri krompirju (Solanum tuberosum L., 2n=4x) medvrstno oprasevanje s S. phurea (2n=2x) povzroca nastanek embrijev z gametnim stevilom kromosomov. Ker je krompir v osnovi tetraploiden, so nastali embriji dihaploidni (2n=2x), saj vsebujejo dve garnituri kromosomov, in niso homozigotni. Princip delovanja temelji na lastnosti dolocenih genotipov S. phurea pri katerih obe spermalni jedri v pelodnem mesicku oplodita polarni jedri embrionalne vrecke. Tako nastane 6x endosperm, ki omogoca rast in razvoj 2x embrija. Ceprav je odstotek semen z dihaploidnimi embriji relativno nizek, jih je mogoce hitro in enostavno odbrati zaradi homozigotnega dominantnega markerja za vijolicne pege semen, ki jih vsebujejo IVP genotipi S. phurea (Maine, 2003). Indukcija haploidov z medvrstnim oprasevanjem je bila uspesna tudi pri citrusih, saj je po in vitro oprasevanju diploidne vrste Citrus clementina Hort. Ex Tan. cv. Nules s pelodom triploidne grenivke Oroblanco uspela regeneriracija 14 haploidov (Germanà in Chiancone, 2001). 2.2.2 Oprasevanje znotraj oprasevalnimi ('inducer') obsevanim pelodom vrste linijami z ali Poznani sta dve vrsti in situ indukcije haploidov iz zenskih gamet, ki temeljita na oprasevanju s pelodom iste vrste. Prva metoda je poznana pri koruzi, pri kateri so odkrili oprasevalno ('inducer') linijo 'Stock 6', ki je po oprasevanju sprozila nastanek do 2,3 % spontanih haploidov (Coe, 1959, cit. po Bohanec, 1994). Linijo so krizali s stevilnimi drugimi linijami in krizance uporabili za oprasevanje z namenom pridobivanja haploidov. Porocajo, da s sodobnimi oprasevalnimi linijami dosegajo ze 8-10 % uspeh (Geiger in Gordillo, 2009; Melchinger in sod., 2013). Tako kot pri krompirju, tudi pri oprasevanju s koruzo oprasevalne linije vsebujejo homozigotni dominantni morfoloski marker (za vijolicno barvo embrija in alevrona) s pomocjo katerega lahko locijo haploidne od hibridnih embrijev. Poleg tega ni potrebno in vitro resevanje embrijev, saj semena s haploidnimi embriji vsebujejo normalen endosperm. Oboje olajsa indukcijo haploidov in povecuje uporabnost tehnike za zlahtnjenje rastlin, saj omogoca izlocanje hibridov brez dodatnih laboratorijskih analiz (Zhang in sod., 2008). V raziskavi Barreta in sodelavcev (2008) so odkrili ggi1 lokus na kromosomu 1, ki je odgovoren za izlocanje kromosomov oprasevalca. Druga moznost in situ ginogeneze z oprasevanjem znotraj vrste je oprasevanje z obsevanim pelodom. Metoda je bila uspesna pri stevilnih rastlinskih vrstah, kar prikazuje preglednica 1. Preglednica 1: Seznam rastlinskih vrst in virov pri katerih so z oprasevanjem z obsevanim pelodom spodbudili nastanek haploidnih rastlin. Table 1: List of plant species and available publications about haploid induction protocols by pollination with irradiated pollen. Vrsta Viri buce Kurtar in sod., 2002, 2009; Kurtar and Balkaya, 2010; Kosmrlj in sod., 2013 cebula Dore in Marie, 1993 crni ribez Naess in sod., 1998 divja cesnja Höfer in Grafe, 2003 hruska Bouvier in sod., 1993 jablana Zhang in Lespinasse, 1991; De Witte in Keulemans, 1994; Hofer in Lespinasse, 1996 kivi Pandey in sod., 1990; Chalak in Legave, 1997; Musial in Przywara, 1998, 1999 kumara Przyborowski in Niemirowicz-Szczytt, 1994; Faris in sod., 1999; Faris in Niemirowicz-Szczytt, 1999; Claveria in sod., 2005 lubenica Sari in sod., 1994 mandarina Froelicher in sod., 2007; Aleza in sod., 2009 melona Sauton in Dumas de Vaulx, 1987; Cuny in sod., 1993; Katoh in sod., 1993; Lotfi in sod., 2003; Gonzalo in sod., 2011; Godbole in Murthy, 2012 nagelj Sato in sod., 2000 oreh Grouh in sod., 2011 krinkar Murovec in sod., 2013 petunija Raquin, 1985 pomelo Yahata in sod., 2010 sliva Peixe in sod., 2000 soncnica Todorova in sod., 1997 Nicotiana Pandey, 1980; Pandey in Phung, 1982 vrtnica Meynet in sod., 1994 298 Metoda temelji na lastnosti peloda obsevanega z UV, ali X zarki, ki po oprasevanju na brazdi normalno kali in pelodni mesicek napreduje skozi vrat pestica do embrionalne vrecke, kjer se tvori embrij. Ali jedri peloda oplodita jajcno celico in polarni jedri in se kromosomi oprasevalca izlocijo sele v kasnejsi embriogenezi ali pa nastanek haploidnega embrija sprozi ze sama kalitev peloda, je za enkrat se nedoreceno. Novejse raziskave nakazujejo na moznost, da do oploditve dejansko pride, vendar se kromosomi iz mocno obsevanega peloda cez cas izlocijo iz jedra (Murovec in Bohanec, 2013). Uspeh metode je, poleg dejavnikov nastetih v drugem poglavju tega prispevka, odvisen od doze obsevanja in razvojne faze embrijev ob resevanju. Vpliv doze sevanja na prezivetje haploidnih embrijev in krizancev je prvi preucil Hertwig leta 1911 v svojih poskusih oplojevanja jajcnih celic zab. Po njem so kasneje pojav poimenovali 'Hertwigov efekt'. V svojih poskusih je opazil, da po oprasevanju s spermalnimi celicami predhodno obsevanimi z nizkimi dozami, velik odstotek embrijev propade zgodaj v razvoju. Tisti, ki prezivijo, pa kazejo razlicne morfoloske spremembe. Oprasevanje s spermalnimi celicami obsevanimi z visokimi dozami, povzroci visji odstotek zivih embrijev, ki so normalnega fenotipa (Hertwig, 1912 cit. po Pandey in Phung, 1982). Kasneje so pojav temeljito preucili in ugotovili, da so mocno obsevane spermalne celice zmozne prodreti v jajcno celico, vendar je niso zmozne oploditi. Kljub temu pa stimulirajo delitev jajcne celice in ginogenetski razvoj embrija. Pri nizjih dozah obsevanja, spermalne celice obdrzijo sposobnost oploditve jajcne celice, vendar zaradi obsevanja na hibrida prenesejo mutacije, ki povzrocajo nenormalen fenotip ali prezgodnjo smrt (razlicni avtorji, cit. po Pandey in Phung, 1982). Pandey in Phung (1982) sta 'Hertwigov efekt' prva opazila pri rastlinah med oprasevanjem stirih vrst rodu Nicotiana. Pri nizjih dozah obsevanja (100200 Gy) je z visanjem doze padal odstotek pridobljenih sejancev, od katerih jih je veliko kmalu po kalitvi propadlo. Sejanci, ki so preziveli do cvetenja, so bili morfolosko razlicni, niso bili podobni materinim rastlinam in so bili vecinoma sterilni. Citoloske analize so pokazale, da so bile rastline aneuploidni krizanci, ki so vsebovali vse kromosome materine rastline in razlicno stevilo kromosomov od oprasevalne rastline. Z visanjem doze obsevanja peloda nad 500 Gy, se je stevilo aneuploidov manjsalo, vecalo pa se je stevilo dihaploidov in podvojenih dihaploidov. Kasneje so vpliv doze sevanja na izid oprasevanja preucevali se pri drugih kmetijsko pomembnih rastlinskih vrstah. Tako so tudi pri kumarah (Claveria in sod., 2005), kiviju (Chalak in Legave, 1997; Musial in Przywara, 1998) in orehu (Grouh in sod., 2011), z visanjem doze obsevanja, uspeli regenerirati vecje stevilo haploidov v primerjavi z nizjimi dozami. Po drugi strani pa visanje doze mocno vpliva na manjsanje stevila nastalih plodov (Przyborowski in Niemirowicz-Szczytt, 1994; Kurtar in sod., 2002; Froelicher in sod., 2007; Kosmrlj in sod., 2013), manjsanje stevila normalno razvitih semen (Cuny in sod., 1993; Przyborowski in NiemirowiczSzczytt, 1994; Chalak in Legave, 1997; Musial in Przywara, 1998; Sugiyama in Morishita, 2000; Lotfi in sod., 2003; Froelicher in sod., 2007), manjso kalivost semen (Chalak in Legave, 1997) in na manjse stevilo nastalih embrijev (Grouh in sod., 2011; Kosmrlj in sod., 2013). Oprasevanje z obsevanim pelodom je najbolj raziskano pri bucevkah (druzina Cucurbitaceae) pri katerih se metoda uporablja ze vrsto let v zlahtniteljskih programih (Sugiyama in Morishita, 2000; Sari in Yetisir, 2002; Kuzuya in sod., 2003; Claveria in sod., 2005). Od prvih poskusov leta 1987 (Sauton in Dumas de Valux, 1987) pa do danes, so s pomocjo oprasevanja z obsevanim pelodom, pridobili haploide pri melonah, lubenicah, kumarah in razlicnih bucah. Metoda temelji na oprasevanju z obsevanim pelodom in kasnejsim resevanjem embrijev na E20A gojiscu, ki sta ga uporabila ze Sauton in Dumas de Valux leta 1987 pri melonah. Resevanje embrijev poteka 3-5 tednov po oprasevanju, ko se iz polnih semen izolira embrije. Ob izolaciji so embriji v razlicnih razvojnih fazah: pri bucah so od tockaste do kotiledonske faze (Kurtar in sod., 2002), pri kumarah so od zgodnje srcaste do kotiledonske faze (Faris in sod., 1999) in pri melonah so od globularne do kotiledonske faze (Cuny in sod., 1993). Kurtar in sodelovci (2002) so dokazali, da je uspesnost regeneracije rastlin odvisna od razvojne stopnje embrijev ob resevanju. Najvisji odstotek regeneracije so dosegli iz embrijev inokuliranih v kotiledonski fazi. Kasneje so opazili, da je z razvojno fazo ob resevanju povezana tudi ploidnost embrijev. Embriji v zgodnejsih fazah razvoja so bili haploidni, medtem ko so bili embriji v kotiledonski fazi izkljucno diploidni. Rezultati so skladni z rezultati Faris in Niemirowicz-Szczytt (1999), ki sta spremljala razvoj embrijev in endospermov kumare po oprasevanju s svezim pelodom in pelodom obsevanim pri 100 ali 300 Gy. Ugotovila sta, da se v primerjavi s kontrolnim oprasevanjem, embriji in endospermi nastali po oprasevanju z obsevanim pelodom, razvijajo pocasneje in kazejo odstopanja od normalne morfologije. Poleg tega so, po oprasevanju z obsevanim pelodom, embriji v kasnejsih razvojnih fazah (mutanti) zaceli propadati ze 9 (100 Gy) oz. 3 dan (300 Gy) po oprasevanju, tako da sta 15 dni po oprasevanju v semenskih zasnovah zasledila samo se embrije v globularni razvojni fazi. Velika prednost indukcije haploidov s pomocjo oprasevanja z obsevanim pelodom je, da pri nekaterih vrstah kot so kivi (Pandey in sod., 1990; Chalak in Legave, 1997), cebula (Dore in Marie, 1993), mandarina (Froelicher in sod., 2007) in vrste rodu Nicotiana (Pandey in Phung, 1982) ni potrebe po resevanju embrijev. Tako pri kiviju puscajo oprasene cvetove na trsih do fizioloske zrelosti plodov, jih nato vernalizirajo in izlocijo semena. Pandey in sodelavci (1990) so slabso in vivo kalivost zrelih partenogenetskih semen izbojsali z in vitro kalitvijo semen na stirih razlicnih hranilnih gojiscih, Chalak in Legave (1997) pa sta kasneje kalitev semen poenostavila in dobila zadovoljiv odstotek trihaploidnih regenerantov tudi po neposredni setvi v vermikulit. Spontana diploidizacija haploidnega jedra po oprasevanju z obsevanim pelodom je bila na podlagi morfoloskega opazovanja regenerantov opazena pri vrstah rodu Nicotiana (Pandey in Phung, 1982), cebuli (Dore in Marie, 1993), soncnici (Todorova in sod., 1997), nageljnu (Sato in sod., 2000) in meloni (Lotfi in sod., 2003). Pri soncnicah so opazili zanimiv pojav spontane diploidizacije haploidov med gojenjem v rastlinjaku. Od 296 regenerantov, katerim so s pretocno citometrijo opravljeno v fazi 2-3 listov dokazali haploidnost, so po 20 dneh rasti v rastlinjaku dobili 239 (81 %) diploidov, 32 (11 %) miksoploidov in le preostalih 25 (8 %) je ostalo haploidnih (Todorova in sod., 1997). Spontano podvojene haploide so samooprasili, linije odbrali glede na lastnosti zanimive za zlahtnjenje in 17 odbranih DH linij analizirali s 4 izoencimskimi 300 markerji. Rastline znotraj vseh linij so bile uniformne, linije pa so bile homozigotne in so vsebovale izoencime materinih ali ocetovskih rastlin. 2.3 Androgeneza S pojmom androgeneza (ali embriogeneza mikrospor) oznacujemo pridobivanje haploidnih embrijev iz moskih gamet. Poznani sta dve metodi in sicer in vitro kultura prasnic, s katero so pred 50 leti pridobili prve haploide (vrsta Datura innoxia; Guha in Maheshwari, 1964, 1966) in kultura izoliranih mikrospor, ki je sledila 10 let kasneje (tobak; Nitsch, 1974). Zaradi velike uspesnosti in uporabnosti pri stevilnih rastlinskih vrstah, je androgeneza najbolj pogosto uporabljena metoda indukcije haploidov pri zlahtnjenju rastlin in genetskih raziskavah. V komercialne namene se redno uporablja pri jecmenu, psenici, koruzi, rizu, tritikali, rzi, tobaku, oljni ogrscici in drugih vrstah rodu Brassica (podrobni protokoli so zbrani v Maluszynski in sod., 2003). Glavne slabosti androgeneze so mocna odvisnost uspeha od genotipa rastline, neodzivnost dolocenih kmetijsko pomembnih vrst (drevesne vrste, strocnice) in modelne rastline Arabidopsis thaliana ter relativno velik delez regeneriranih albino rastlin. Metoda temelji na sposobnosti nezrelega peloda ­ mikrospor, da ob primernih drazljajih, spremeni razvojno pot iz gametofitne (dozorevanja peloda) v sporofitno (nastanek embrija). Ob ugodnih pogojih v in vitro razmerah, nastane haploidni embrij neposredno ali pa posredno preko kulture haploidnega kalusa. Androgeneza iz prasnic je najbolj preprosta metoda pri kateri se po povrsinski sterilizaciji predtretiranih cvetnih brstov, prasnice asepticno izlocijo in gojijo na hranilnih gojiscih. Kultura izoliranih mikrospor se zacne podobno, le da se izolirane prasnice potopi v tekoce gojisce, kjer se ob stalnem tresenju izlocijo mikrospore. Druga moznost izolacije mikrospor je trenje steriliziranih cvetnih brstov v tekocem gojiscu in kasnejse locevanje mikrospor od somatskega tkiva s filtriranjem in centrifugiranjem. Ceprav je izolacija mikrospor bolj zahtevna metoda, je njena velika prednost locevanje mikrospor od sporofitnega tkiva. Tako je onemogocen vpliv sporofitnega tkiva na embriogenezo mikrospor in hkrati se prepreci nevarnost regeneracije heterozigotov iz somatskih celic. Za uspesno spremembo razvojne poti iz gametofitnega v sporofitni razvoj, je najpomembnejsi dejavnik razvojna faza mikrospor. Za vecino rastlinskih vrst je najbolj primeren cas prve haploidne mitoze, ko so mikrospore v pozni enojedrni in zgodnji dvojedrni fazi (Touraev in sod., 1997; Maraschin in sod., 2005). Stresni dejavniki, ki se uporabljajo v ta namen (temperaturno pred-tretiranje, stradanje mikrospor in osmotski stres), se razlikujejo glede na rastlinsko vrsto. Tako se pri jecmenu, psenici, koruzi, rizu, tritikali in rzi uporablja pred-tretiranje na nizkih temperatureh, pri vrstah rodu Brassica in tobaku pa na visokih temperaturah, oboje vec ur ali dni. Pri oljni ogrscici in tobaku so dokazali, da lahko embriogenezo sprozijo razlicni stresni dejavniki, odvisno od razvojne faze mikrospor. Tako za enojedrne mikrospore oljne ogrscice zadostuje temperatura 32 ºC, za dvojedrne pa je potrebna ze temperatura 41 ºC (Maraschin in sod., 2005). Pri tobaku, temperaturni sok uspesno vodi v embriogenezo enocelicne mikrospore, medtem ko dvojedrnih mikrospor ne in jih je potrebno izpostaviti stradanju (Touraev in sod., 1997). 3 DOLOCANJE PLOIDNOSTI IN PREVERJANJE HOMOZIGOTNOSTI REGENERANTOV Med in vitro kulturo cvetov in njihovih delov (prasnice, plodnice, itd.) se lahko na hranilnih gojiscih regenerirajo poleg haploidnih tudi diploidne rastline in celo rastline visjih stopenj ploidnosti (Sunderland, 1974; Germanà 2005, 2006, 2009; Kosmrlj in sod., 2013; Murovec in Bohanec, 2013). V preteklosti so za dolocanje ploidnosti uporabljali posredne metode kot so spremljanje morfoloskih lastnosti rastlin (velikost rastlin in listov, oblika cvetov), fertilnosti rastlin, bujnost rastlin, stevilo kloroplastov v celicah zapiralkah in velikost listnih rez. Metode so bile zamudne, nenatancne in pod vplivom nepredvidljivih okoljskih dejavnikov. Dandanes se uporabljajo predvsem citoloske tehnike stetja metafaznih kromosomov (primer protokola je predstavljen v Maluszynska, 2003) in merjenje kolicine DNA v jedrih s pomocjo pretocne citometrije (primer protokola je predstavljen v Bohanec, 2003). Slednja metoda predstavlja najhitrejso in najbolj zanesljivo tehniko dolocanja ploidnosti regenerantov. Omogoca zelo zgodnje dolocanje, saj za analizo zadostujejo ze majhne kolicine rastlinskega materiala, tako da se analiza lahko opravi se v fazi tkivne kulture. Poleg tega je s pomocjo pretocne citometrije mogoce odkrivanje miksoploidnih regenerantov, kar z ostalimi tehnikami ni mogoce. Diploidni regeneranti so lahko posledica spontane diploidizacije gamet (so spontani podvojeni haploidi), somatski regeneranti iz diploidnih starsevskih celic ali krizanci po samooprasevanju oz. tujeoprasevanju. Zato je za dokoncno potrditev DH potrebna analiza homozigotnosti. V ta namen se uporabljajo stevilne metode, odvisno od rastlinske vrste in dostopnih markerskih sistemov. V preteklosti je analiza diploidnih regenerantov temeljila predvsem na fenotipskih markerjih (Raquin, 1985; Dore in Marie, 1993; De Witte in Keulemans, 1994; Maine, 2003) ter na samooprasevanju pridobljenih regenerantov in morfoloskem testiranju potomstva (Sato in sod., 2000). Potomci DH naj bi bili izenaceni za vse lastnosti in pri njih naj ne bi bilo opaziti segregacije lastnosti. Kasneje so se uveljavili stevilni molekulski markerji, med njimi sprva izoencimi (Campion s sod., 1995; Bohanec in Jakse, 1999; Germanà in Chiancone, 2001; Höfer in Grafe, 2003), kasneje pa se DNA molekulski markerji kot npr. AFLP (Eeckhaut s sod., 2001) in RAPD (Bohanec in sod., 1995; Eimert in sod., 2003; Yahata in sod., 2005 a, b). Zaradi kodominantnega nacina dedovanja, relativne pogostosti v genomu evkariontov, visoke stopnje polimorfizma, preprostega in nedvoumnega vrednotenja (PCR namnozevanje, dolocanje dolzine z avtomatskimi sekvencnimi aparati), mikrosateliti v zadnjih letih nadomescajo ostale metode preverjanja homozigotnosti regenerantov. V primerih indukcije haploidov z inokulacijo prasnic ali drugih delov ne-oprasenih cvetov, je za potrditev DH dovolj analiza enega mikrosatelitnega lokusa, ki je pri izvorni rastlini heterozigoten. Pri indukciji haploidov s pomocjo oprasevanja, kjer obstaja moznost nenamerne samooploditve ali oploditve s strani oprasevalca, pa je potrebno analizirati vec lokusov. Tako so Kosmrlj in sodelavci (2013) odkrili, da je za nedvoumno potrditev izvora diploidnih regenerantov buc v vecini primerov zadostna analiza na treh lokusih. Mikrosatelite so uporabili za dolocanje genetskega izvora diploidov pri stevilnih rastlinskih vrstah kot so Citrus clementina (Germanà in Chiancone, 2003; Germanà in sod., 2005), jablana (Höfer in sod., 2002; Vanwynsberghe in sod., 2005), hruska (Bouvier in sod., 2002), psenica (Muranty in sod., 2002), koruza (Aulinger in sod., 2003; Tang in sod., 2006), mandarina (Froelicher in sod., 2007), oranzni krinkar (Murovec in Bohanec, 2013) in oljne buce (Kosmrlj in sod., 2013). Za hitro in poceni locevanje med haploidi in nezazeljenimi heterozigotnimi diploidi po indukciji z oprasevanjem, so najbolj primerni morfoloski znaki, ki se izrazijo zgodaj v razvoju. Tako pri koruzi poznajo gen R1-nj, ki ob prisotnosti dominantnih genov A1 ali A2 in C2 povzroci rdece obarvanje alevronske plasti endosperma in v predelu skuteluma ­ scitka (Geiger in Gordillo, 2009). Gen R1-nj mora biti v materini rastlini homozigotno recesiven, v oprasevalni liniji pa homozigotno dominanten. Po oprasevanju, se selekcija opravi ze med zrnjem, saj se pri zrnju z nezazelenimi hibridnimi embriji opazi rdece obarvano krono v predelu alevronske plasti endosperma in skuteluma, zrnje s haploidnim embrijem pa vsebuje rdeco krono samo v alevronski plasti zaradi normalne oploditve polarnih jeder. Nedavno so predstavili nov morfoloski znak, ki naj bi v prihodnje sluzil za locevanje haploidov od krizancev koruze. S krizanjem so ustvarili dve novi oprasevalni liniji z izredno visoko vsebnostjo olja, hibridne potomce pa so dolocili s pomocjo jedrne magnetne resonance (nuclear magnetic resonance, NMR), saj so vsebovali vecjo vsebnost olja od haploidnih (Melchinger in sod., 2013). Glavna prednost predstavljene novitete je v veliki zanesljivosti in moznosti avtomatizacije, hitrost pa je trenutno 20 semen na minuto. Podoben princip z barvnim morfoloskim znakom uporabljajo tudi pri krompirju, po oprasevanju s S. phurea. Dominantni gen povzroca vijolicaste pike na semenih in vijolicen obroc v predelu nodija stebla, tako da lahko selekcija poteka v dveh razvojnih fazah. Tako pri koruzi kakor pri krompirju pa opisana barvna morfoloska znaka ne moreta lociti haploidnih embrijev od hibridov po nenamernem samooprasevanju, zato so potrebni se dodatni morfoloski ali molekulski markerji. 4 PODVAJANJE STEVILA KROMOSOMOV Haploidi zaradi enojnega stevila kromosomov ne tvorijo funkcionalnih gamet (so sterilni) in je za pridobivanje fertilnih linij potrebno stevilo njihovih kromosomov podvojiti. Za pridobivanje t.i. podvojenih haploidov (doubled haploids, DH), homozigotnih na vseh lokusih, se uporabljajo razlicne tehnike, ki vecinoma vkljucujejo tretiranje z antimitoticnimi sredstvi kot so kolhicin (v zacetku izoliran iz jesenskega podleska Colchicum autumnale L.), orizalin, trifluralin, amiprofos-metil (AMP) in drugi. Ta sredstva se lahko uporabijo v razlicnih fazah indukcije haploidov od najzgodnejse faze mikrospor, ko jih dodajajo v indukcijsko gojisce, pa vse do faze aklimatiziranih haploidnih rastlin, pri katerih se sredstva nanasajo na meristeme. Novejse raziskave nakazujejo moznost podvajanja kromosomov preko adventivne regeneracije (Maine, 2003; Skof in sod., 2007) brez uporabe antimitoticnih sredstev. Tako so pri salotki na gojiscu za indukcijo 302 ginogeneze opazili spontano podvajanje kromosomov somatskih regenerantov, v tem primeru iz diploidnega v tetraploidno stevilo (Sulistyaningsih in sod., 2006). Metodo so uspesno uporabili za podvajanje kromosomov haploidnih rastlin cebule Alan in sodelavci (2007), ki so s somatsko regeneracijo na gojiscih za indukcijo ginogeneze pridobili 61 % diploidnih regenerantov. Odstotek regeneriranih diploidov se je ob dodajanju 12,5, 25 ali 50 M kolhicina v gojisce celo zmanjsal, ob hkratnem povecanju odstotka regeneriranih tetraploidov in miksoploidov. S somatsko regeneracijo so iz miksoploidnega maticnega materiala uspeli regenerirati same diploide. Se boljse rezultate so dosegli Jakse in sodelavci (2010) s somatsko regeneracijo iz kulture cvetnih brstov, kjer so dobili do 83 % uspesnost podvajanja kromosomov haploidnih in do 100 % uspesnost podvajanja kromosomov miksoploidnih cebul. 5 ZAKLJUCEK Petdeset let od prvega sprozenega nastanka haploidnih rastlin so tehnike indukcije in regeneracije haploidov se vedno oz. vedno bolj aktualne. Od prvotne uporabe v zlahtnjenju najpomembnejsih poljscin, se njihovo pridobivanje siri na druge vrste kot so zelenjadnice, okrasne, zdravilne, aromaticne in krmne rastline. Poleg tega dobivajo (podvojeni) haploidi z novimi tehnologijami (npr. dolocanje zaporedij celotnih genomov) nov pomen in vlogo v sodobnih genetskih studijah. Zato menim, da bodo haploidi in podvojeni haploidi tudi v prihodnje igrali pomembno vlogo v kmetijstvu in bazicnih raziskavah. 6 VIRI Alan A.R., Brants A., Cobb E., Goldschmied P.A., Mutschler M.A., Earle E.D. 2004. Fecund gynogenic lines from onion (Allium cepa L.) breeding materials. Plant Science, 167, 5: 10551066 Alan A.R., Lim W., Mutschler M.A., Earle E.D. 2007. Complementary strategies for ploidy manipulations in gynogenic onion (Allium cepa L.). Plant Science, 173: 25-31 Aleza P., Juarez J., Hernandez M., Pina J.A., Ollitrault P., Navarro L. 2009. Recovery and characterization of a Citrus clementina Hort. ex Tan. 'Clemenules' haploid plant selected to establish the reference whole Citrus genome sequence. BMC Plant Biology, 9, st. clanka 110 Aulinger I.E., Peter S.O., Schmid J.E., Stamp P. 2003. Rapid attainment of a doubled haploid line from transgenic maize (Zea mays L.) plants by means of anther culture. In Vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 39: 165-170 Bal U., Touraev A. 2009. Microspore embryogenesis in selected medicinal and ornamental species of the Asteraceae. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 219-229 Barret P., Brinkmann M., Beckert M. 2008. A major locus expressed in the male gametophyte with incomplete penetrance is responsible for in situ gynogenesis in maize. Theoretical and Applied Genetics, 117: 581-594 Bohanec B. 1994. Induction of gynogenesis in agricultural crops: a review. V: Proceedings of the international colloquium on impact of plant biotechnology on agriculture, December 5th - 7th 1994, Rogla, Slovenia. Javornik B., Bohanec B., Kreft I. (ur.). Ljubljana, Biotechnical Faculty, Agronomy Department, Centre for Plant Biotechnology and Breeding: 43-55 Bohanec B. 2003. Ploidy determination using flow cytometry. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 397-403 Bohanec B. 2009. Doubled haploids via gynogenesis. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 35-46 Bohanec B. Jakse M., Ihan A., Javornik B., 1995. Studies of gynogenesis in onion (Allium cepa L.): induction procedures and genetic analysis of regenerants. Plant Science, 104: 215-224 Bohanec B., Jakse M. 1999. Variations in gynogenic response among long-day onion (Allium cepa L.) accessions. Plant Cell Reports, 18: 737-742 Bouvier L., Guérif P., Djulbic M., Durel C.E., Chevreau E., Lespinasse Y. 2002. Chromosome doubling of pear haploid plants and homozygosity assessment using isozyme and microsatellite markers. Euphytica, 123: 255-262 Bouvier L., Zhang Y.X., Lespinasse Y. 1993. Two methods of haploidization in pear, Pyrus communis L.: greenhouse seedling selection and in situ parthenogenesis induced by irradiated pollen. Theoretical and Applied Genetics, 87: 229-232 Campion B., Bohanec B., Javornik B. 1995. Gynogenic lines of onion (Allium cepa L.): evidence of their homozygosity. Theoretical and Applied Genetics, 91: 598-602 Chalak L., Legave J.M. 1997. Effects of pollination by irradiated pollen in Hayward kiwifruit and spontaneous doubling of induced parthenogenetic trihaploids. Scientia Horticulturae, 68: 83-93 Claveria E., Garcia-Mas J., Dolcet-Sanjuan R. 2005. Optimization of cucumber doubled haploid line production using in vitro rescue of in vivo induced 303 parthenogenic embryos. Journal of the American Society for Horticultural Science, 130, 4: 555-560 Cuny F., Grotte M., Dumas de Vaulx R., Rieu A. 1993. Effects of gamma irradiation of pollen on parthenogenetic haploid production in muskmelon (Cucumis melo L.). Environmental and Experimental Botany, 33, 2: 301-312 De Witte K., Keulemans J. 1994. Restrictions of the efficiency of haploid plant production in apple cultivar Idared, through parthenogenesis in situ. Euphytica, 77: 141-146 Deimling S., Fleihinghaus-Roux T. 1996. Haploids in rye. V: In vitro haploid production in higher plants. Jain S.M., Spory S.K., Veilleux R.E. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 181-204 Devaux P., Kasha K.J. 2009. Overview of barley doubled haploid production. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 47-63 Dore C., Marie F. 1993. Production of gynogenetic plants of onion (Allium cepa L.) after crossing with irradiated pollen. Plant Breeding, 111: 142-147 Eeckhaut T., Werbrouck S., Dendauw J., Bockstaele E.V., Dobergh P. 2001. Induction of homozygous Spathiphyllum wallisii genotypes through gynogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 67:181-189 Eimert K., Reutter G., Strolka B. 2003. Fast and reliable detection of doubled-haploids in Asparagus officinalis by stringent RAPD-PCR. Journal of Agricultural Science, 141: 73-78 Faris N.M., Niemirowicz-Szczytt K. 1999. Cucumber (Cucumis sativus L.) embryo development in situ after pollination with irradiated pollen. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 41: 111118 Faris N.M., Nikolova V., Niemirowicz-Szczytt K. 1999. The effect of gamma irradiation dose on cucumber (Cucumis sativus L.) haploid embryo production. Acta Physiologiae Plantarum, 21, 4: 391-396 Ferrant V., Bouharmont J. 1994. Origin of gynogenetic embryos of Beta vulgaris L. Sexual Plant Reproduction, 7: 12-16 Ferrie A.M.R. 2009. Current status of doubled haploids in medicinal plants. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 209-217 Ferrie A.M.R., Caswell K.L. 2011. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 104, 3: 301-309 304 Forster B.P., Heberle-Bors E., Kasha K.J., Touraev A. 2007. The resurgence of haploids in higher plants. Trends in Plant Science, 368-375 Froelicher Y., Bassene J.B., Jedidi-Neji E., Dambier D., Morillon R., Bernardini G., Costantino G., Ollitrault P. 2007. Induced parthenogenesis in mandarin for haploid production: induction procedures and genetic analysis of plantlets. Plant Cell Reports, 26:937-944 Geiger H.H., Gordillo G.A. 2009. Doubled haploids in hybrid maize breeding. Maydica, 54: 485-499 Gémes-Juhász A., Baloh P., Ferenczy A., Kristf Z. 2002. Effect of optimal stage of female gametophyte and heat treatment on in vitro gynogenesis induction in cucumber (Cucumis sativus L.). Plant Cell Reports, 21: 105-111 Germanà M.A. 2006. Doubled haploid production in fruit crops. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 86: 131­146 Germanà M.A. 2009. Haploid and doubled haploids in fruit trees. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 241­263 Germanà M.A., Chiancone B, Lain O., Testolin R. 2005. Anther culture in Citrus clementina: a way to regenerate tri-haploids. Australian Journal of Agricultural Research, 56: 839-845 Germanà M.A., Chiancone B. 2001. Gynogenetic haploids of Citrus after in vitro pollination with triploid pollen grains. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 66: 59-66 Germanà M.A., Chiancone B. 2003. Improvement of Citrus clementina Hort. Ex Tan. microsporederived embryoid induction and regeneration. Plant Cell Reports, 22: 181-187 Godbole M., Murthy H.N. 2012. Parthenogenetic haploid plants using gamma irradiated pollen in snapmelon (Cucumis melo var. momordica). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 109: 167-170 Gonzalo M.J., Claveria E., Monforte A.J., DolcetSanjuan R. 2011. Parthenogenic haploids in melon: Generation and molecular characterization of a doubled haploid line population. Journal of the American Society for Horticultural Science, 136: 145-154 Grouh M. S.H., Vahdati K., Lotfi M., Hassani D., Biranvand N. P. 2011. Production of haploids in persian walnut through parthenogenesis induced by gamma-irradiated pollen. Journal of the American Society for Horticultural Science, 136, 3: 198­204 Guha S., Maheshwari S.C. 1964. In vitro production of embryos from anthers of Datura. Nature, 204, 4957: 497 Guha S., Maheshwari, S.C. 1966. Cell division and differentiation of embryos in the pollen grains of Datura in vitro. Nature, 212: 97-98 Höfer M., Gomez A., Aguiriano E., Manzanera J.A., Bueno M.A. 2002. Analysis of simple sequence repeat markers in homozygous lines of apple. Plant Breeding, 121: 159-16 Höfer M., Grafe Ch. 2003. Induction of doubled haploids in sweet cherry (Prunus avium L.). Euphytica, 130: 191-197 Höfer M., Lespinasse Y. 1996. Haploidy in apple. V: In vitro haploid production in higher plants, Vol. 3: Important selected plants. Jain S.M., Sopory S.K., Veilleux R.E. (ur). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 261-276 Hosp J., Maraschin S.F., Touraev A., Boutilier K. 2007. Functional genomics of microspore embryogenesis. Euphytica, 158: 275-285 Jakse M., Hirschegger P., Bohanec B., Havey M.J. 2010. Evaluation of gynogenic responsiveness and pollen viability of selfed doubled haploid onion lines and chromosome doubling via somatic regeneration. Journal of the American Society for Horticultural Science, 135, 1: 67-73 Kasha K.J., Hu T.C., Oro R., Simion E., Shim Y.S. 2001. Nuclear fusion leads to chromosome doubling during mannitol pretreatment of barley (Hordeum vulgare L.) microspores. Journal of Experimental Botany, 52, 359: 1227-1238 Kasha K.J., Kao K.N. 1970. High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature, 225: 874-876 Katoh N., Hagimori M., Iwai S. 1993. Production of haploid plants of melon by pseudofertilized ovule culture. Plant Tissue Culture Letters, 10: 60-66 Kosmrlj K., Murovec, J., Bohanec B. 2013. Haploid induction in hull-less seed pumpkin through parthenogenesis induced by X-ray-irradiated pollen. Journal of the American Society for Horticultural Science, 138: 310-316 Kurtar E.S., Balkaya A. 2010. Production of in vitro haploid plants from in situ induced haploid embryos in winter squash (Cucurbita maxima Duchesne ex Lam.) via irradiated pollen. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture, 102: 267­277 Kurtar E.S., Balkaya A., Ozbakir M., Ofluoglu T. 2009. Induction of haploid embryo and plant regeneration via irradiated pollen technique in pumpkin (Cucurbita moschata Duchesne ex. Poir). African Journal of Biotechnology, 8: 5944­5951 Kurtar E.S., Sari N., Abak K. 2002. Obtention of haploid embryos and plants through irradiated pollen technique in squash (Cucurbita pepo L.). Euphytica, 127: 335-344 Kuzuya M., Hosoya K., Yashiro K. Tomita K., Ezura H. 2003. Powdery mildew (Sphaerotheca fuliginea) resistance in melon is selectable at the haploid level. Journal of Experimental Botany, 54, 384: 1069-1074 Laurie D.A., Bennett M.D. 1988. The production of haploid wheat plants from wheat x maize crosses. Theoretical and Applied Genetics, 76: 393-397 Lotfi M., Alan A.R., Henning M.J., Jahn M.M., Earle E.D. 2003. Production of haploid and doubled haploid plants of melon (Cucumis melo L.) for use in breeding for multiple virus resistance. Plant Cell Reports, 21: 1121-1128 Maine M.J. 2003. Potato haploid technologies. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 241-247 Maluszynska J. 2003. Cytogenetic tests for ploidy level analyses ­ chromosome counting. V: Doubled haploid production in crop plants: A manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 391-395 Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. 2003. Doubled haploid production in crop plants, a manual. Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 428 str. Maraschin S.F., de Priester W., Spaink H.P., Wang M. 2005. Androgenic switch: an example of plant embryogenesis from the male gametophyte perspective. Journal of Experimental Botany, 56, 417: 1711-1726 Melchinger A.E., Schipprack W., Würschum T., Chen S., Technow F. 2013. Rapid and accurate identification of in vivo-induced haploid seeds based on oil content in maize. Scientific Reports, 3, st. clanka 2129 Meynet J., Barrade R., Duclos A., Siadous R. 1994. Dihaploid plants of roses (Rosa x hybrida, cv 'Sonia') obtained by parthenogenesis induced using irradiated pollen and in vitro culture of immature seeds. Agronomie, 2: 169-175 Muranty H., Sourdille P., Bernard S., Bernard M. 2002. Genetic characterization of spontaneous diploid androgenetic wheat and triticale plants. Plant Breeding, 121: 470-474 Murovec J., Bohanec B. 2013. Haploid induction in Mimulus aurantiacus Curtis obtained by pollination with gamma irradiated pollen. Scientia Horticulturae, 162: 218-225 Musial K., Bohanec B., Jakse M., Przywara L. 2005. The development of onion (Allium cepa L.) embryo sacs in vitro and gynogenesis induction in relation to flower size. In vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 41: 446-452 Musial K., Bohanec B., Przywara L. 2001. Embryological study on gynogenesis in onion (Allium cepa L.). Sexual Plant Reproduction, 13: 335-341 Musial K., Przywara L. 1998. Influence of irradiated pollen on embryo and endosperm development in kiwifruit. Annals of Botany, 82: 747-756 Musial K., Przywara L. 1999. Pollination with heavily irradiated pollen in Nicotiana: induced parthenogenesis and embryological study. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 41: 127137 Naess S.K., Swartz H.J., Bauchan G.R. 1998. Ploidy reduction in blackberry. Euphytica, 99: 57-73 Nitsch C, 1974. Pollen culture - a new technique for mass production of haploid and homozygous plants. V: Haploids in higher plants: advances and potential : proceedings of the first international symposium, Guelph, Ontario, Canada. Kasha K.J. (ur). University of Guelph: 123­135 Pandey K.K. 1980. Parthenogenetic diploidy and egg transformation induced by irradiated pollen in Nicotiana. New Zeland Journal of Botany, 18, 2: 203-207 Pandey K.K., Phung M. 1982. 'Hertwig effect in plants: induced parthenogenesis through the use of irradiated pollen. Theoretical and Applied Genetics, 62: 295-300 Pandey K.K., Przywara L., Sanders P.M. 1990. Induced parthenogenesis in kiwifruit (Actinidia deliciosa) through the use of lethally irradiated pollen. Euphytica, 51: 1-9 Peixe A., Campos M.D., Cavaleiro C., Barroso J., Pais M.S. 2000. Gamma-irradiated pollen induces the formation of 2n endosperm and abnormal embryo development in Euroean plum (Prunus domestica L., cv. `Rainha Claudia Verde'. Scientia Horticulturae, 86, 4: 267-278 Przyborowski J., Niemirowicz-Szczytt K. 1994. Main factors affecting cucumber (Cucumis sativus L.) 306 haploid embryo development and haploid plant characteristics. Plant Breeding, 112: 70-75 Raquin C. 1985. Induction of haploid plants by in vitro culture of Petunia ovaries pollinated with irradiated pollen. Zeitschrift für Pflanzenzüchtung, 94: 166169 Rines H.W. 2003. Oat haploid from wide hybridization. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 155-159 Sari N., Abak K., Pitrat M., Rode J.C., Dumas de Vaulx R. 1994. Induction of parthenogenetic haploid embryos after pollination by irradiated pollen in watermelon. HortScience, 29, 10: 1189-1190 Sari N., Yetisir H. 2002. Some agronomical characteristics of doubled haploid lines produced by irradiated pollen technique and parental diploid genotypes in melons. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 26: 311-317 Sato S., Katoh N., Yoshida H., Iwai S., Hagimori M. 2000. Production of doubled haploid plants of carnation (Dianthus caryophyllus L.) by pseudofertilized ovule culture. Scientia Horticulturae, 83: 301-310 Sauton A., Dumas De Vaulx R. 1987. Obtention de plantes haploides chez le melon (Cucumis melo L.) par gynogenese induite par pollen irradie. Agronomie, 7, 2: 141­148 Segui-Simarro J., Nuez F. 2008. How microspores transform into haploid embryos: changes addociated with embryogenesis induction and microspore-derived embryogenesis. Physiologia Plantarum, 134: 1-12 Sugiyama K., Morishita M. 2000. Production of seedless watermelon using soft-X-irradiated pollen. Scientia Horticulturae, 84: 255-264 Sulistyaningsih E., Aoyagi Y., Tashiro Y. 2006. Flower bud culture of shallot (Allium cepa L. Aggregatum group) with cytogenetic analysis of resulting gynogenic plants and somaclones. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 86: 249-255 Sunderland N. 1974. Anther culture as a means of haploid production. V: Haploids in higher plants: advances and potential : proceedings of the first international symposium, Guelph, Ontario, Canada. Kasha K.J. (ur). University of Guelph: 91-122 Skof S., Bohanec B., Kastelec D., Luthar Z. 2007. Spontaneous induction of tetraploidy in hop using adventitious shoot regeneration method. Plant Breeding, 126, 4: 416-421 Tang F., Tao Y., Zhao T., Wang G. 2006. In vitro production of haploid and doubled haploid plants from pollinated ovaries of maize (Zea mays L.). Plant Cell Tissue Organ Culture, 84: 233-237 Testillano P.S., Risueno M.C. 2009. Tracking gene and protein expression during microspore embryogenesis by confocal laser scanning microscopy. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 339-347 Thomas T.D. 2004. Embryological observations on unpollinated ovary culture of mulberry (Morus alba L.). Acta Biologica Cracovensia Series Botanica, 46: 87-94 Thomas W.T.B., Forster B.P., Gertsson B. 2003. Doubled haploids in breeding. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 337-349 Todorova M., Ivanov P., Shindrova P., Christov M., Ivanova I. 1997. Doubled haploid production of sunflower (Helianthus annuus L.) through irradiated pollen-induced parthenogenesis. Euphytica, 97: 249-254 Touraev A., Stoger E., Voronin V., Heberle-Bors E. 1997. Plant male germ line transformation. Plant Journal, 12, 4: 949-956 Vanwynsberghe L., De Witte K., Coart E., Keulemans J. 2005. Limited application of homozygous genotypes in apple breeding. Plant Breeding, 124: 399-403 Wedzony M. 2003. Protocol for doubled haploid production in hexaploid triticale (xTriticosecale Wittm.) by crosses with maize. V: Doubled haploid production in crop plants, a manual. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (ur.). Dordrecht, Kluwer Academic Publishers: 135-140 Wedzony M., Forster B.P., Zur I., Golemiec E., Szechynske-Hebda M., Dubas E., Gotebiowska G. 2009. Progress in doubled haploid technology in higher plants. V: Advances in haploid production in higher plants. Touraev A., Forster B.P., Jain S.M. (ur.). Springer: 1-33 Yahata M., Harusaki S., Komatsu H., Takami K., Kunitake H., Yabuya T., Yamashita K., Toolapong P. 2005a. Morphological characterization and molecular verification of a fertile haploid pummelo (Citrus grandis Osbeck). Journal of the American Society for Horticultural Science, 130: 34-40 Yahata M., Kunitake H., Yabuya T., Yamashita K., Kashihara Y., Komatsu H. 2005b. Production of a doubled haploid from a haploid pummelo using colchicine treatment of axillary shoot buds. Journal of the American Society for Horticultural Science. 130: 899-903 Yahata M., Yasuda K., Nagasawa K., Harusaki S., Komatsu H., Kunitake H. 2010. Production of haploid plant of `Banpeiyu' pummelo (Citrus maxima (Burm.) Merr.) by pollination with soft xray-irradiated pollen. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, 79: 239-245 Zhang Y.X., Lespinasse Y. 1991. Pollination with gamma-irradiated pollen and development of fruits, seeds and parthenogenetic plants in apple. Euphytica, 54: 101-109 Zhang Z.L., Qiu F.Z., Liu Y.Z., Ma K.J., Li Z.Y., Xu S.Z. 2008. Chromosome elimination and in vivo haploid production induced by Stock 6-derived inducer line in maize (Zea mays L.). Plant Cell Reports, 27, 12: 1851-1860

Journal

Acta Agriculturae Slovenicade Gruyter

Published: Sep 1, 2013

There are no references for this article.